Study of the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis: development of molecular tools and morphology evaluation

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis, a thermal dimorphic fungus, is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, the most common systemic mycosis affecting the rural population of Latin America. During the last decade, molecular approaches have allowed a broader insight into P. brasiliensis. However, knowledge regarding fundamental biology of this fungus has been greatly hampered by the absence of appropriate genetic tools. We present results concerning the development of a strategy for gene targeted mutagenesis that could increase the probability of homologous recombination (HR) in P. brasiliensis, using antisense RNA (aRNA) technology to down-regulate the KU80 gene, a key component of the nonhomologous end joining (NHEJ) pathway. However, the aRNAs developed within this work were not able to downregulate PbKU80’s expression, thus other targeted sequences should be employed. The present work also focuses on the analysis of different morphological features (mother cell size and form; bud number, size and form) and possible correlations that might exist among them, and between the expression of the Rholike GTPase Cdc42 (Pbcdc42p), a pivotal molecule in cellular division and shape. We used real-time PCR (RT-PCR) to determine PbCDC42 transcript levels and stereomicroscopy (by contour measurements of 150 mother cells and buds) for morphological analysis of exponentially growing batch culture yeast cells from the 3 described cryptic species (S1, PS2, and PS3), using both clinical and environmental isolates. We show that cell size and cell form of both the mother and bud cells are very heterogeneous both within the same strain and among the strains. Regarding bud number per mother cell, most strains showed no predominance or budding pattern. Moreover, no associations were detected between mother cell and bud cell size and form, suggesting that P. brasiliensis yeast cells do not obey the critical mass rule between mother and daughter cells conversely to other yeast cells like Saccharomyces cerevisiae. Interestingly, expression of PbCDC42, although heterogeneous among the groups of the 3 cryptic species, seems to show a negative correlation with bud number in the tested strains, but not with any of the other analyzed morphological features. Altogether, this study provides a quantitative assessment of morphological traits of P. brasiliensis yeast cells, supporting the hypothesis that P. brasiliensis does not follow standard rules of cell growth.

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termo-dimórfico, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistémica mais comum que afecta a população rural da América Latina. Durante a última década, abordagens moleculares têm permitido uma visão mais ampla sobre P. brasiliensis. No entanto, o conhecimento acerca da biologia fundamental deste fungo tem sido dificultado pela ausência de ferramentas moleculares adequadas. Neste trabalho apresentamos resultados relativos ao desenvolvimento de uma estratégia para mutagénese dirigida que poderia aumentar a probabilidade de recombinação homóloga (RH) em P. brasiliensis, aplicando a tecnologia de RNA antisense (aRNA) para diminuir a expressão do gene KU80, um interveniente chave na via nonhomologous end joining (NHEJ). No entanto, as moléculas antisense desenvolvidas no âmbito deste trabalho não foram capazes de reduzir a expressão de PbKU80, assim, outras sequências antisense deverão ser desenvolvidas. O presente trabalho também se debruçou na análise de diferentes características morfológicas (tamanho e forma da célula mãe; número, tamanho e forma das gémulas) e possível correlação que possa existir entre elas, e entre a expressão da Rho-like GTPase CDC42 (Pbcdc42p), uma molécula crucial na forma e divisão celulares. Usámos a técnica de PCR em tempo real para determinar os níveis de expressão de PbCDC42 e a estereomicroscopia (por medição do contorno de 150 células mãe e suas gémulas) para a análise morfológica de células de levedura em crescimento exponencial pertencentes a 3 espécies crípticas descritas (S1, PS2 e PS3), usando tanto isolados clínicos como ambientais. Mostrámos que tanto o tamanho como a forma de ambas as células mãe e respectivas gémulas são muito heterogéneos, tanto para a mesma estirpe, como entre estirpes diferentes. Quanto ao número de gémulas por célula mãe, na maioria das estirpes não se verificou qualquer predominância ou padrão de gemulação. Além disso, não foram encontradas associações entre o tamanho e a forma das células mãe e respectivas gémulas, sugerindo que as células leveduriformes de P. brasiliensis não obedecem ao modelo ideal de gemulação exibido entre célula mãe e gémula, ao contrário de outras leveduras como Saccharomyces cerevisiae. Curiosamente, a expressão de PbCDC42, embora heterogénea entre as 3 espécies crípticas, parece apresentar uma correlação negativa com o número de gémulas nas estirpes testadas, mas não com qualquer das outras características morfológicas analisadas. Em suma, este estudo faculta uma avaliação quantitativa das características morfológicas das células leveduriformes de P. brasiliensis, apoiando a hipótese de que este fungo dimórfico não segue as regras standard do crescimento celular.