Caracterização molecular da displasia arritmogénica ventricular direita em pacientes portugueses com suspeita clínica da doença: uma abordagem de diagnóstico molecular mais rápida e económica

Abstract

A Displasia Arritmogénica Ventricular Direita (DAVD) é uma cardiomiopatia primária rara que apresenta uma incidência de 1 em 2000 até 1 em 5000 indivíduos na população em geral. No entanto, é considerada uma importante causa de morte súbita em jovens e especialmente em atletas. A DAVD é, geralmente, uma doença hereditária, com padrão de transmissão autossómico dominante, caracterizada histologicamente pela substituição de tecido do miocárdio por tecido adiposo e fibroso no ventrículo direito, podendo existir envolvimento do ventrículo esquerdo numa fase mais tardia da doença. Estudos reportam que mutações nos genes que codificam para proteínas desmossomais conseguem justificar a doença em cerca de 50 % dos pacientes com DAVD. O teste genético é útil na confirmação do diagnóstico clínico, particularmente nos indivíduos que não preencham todos os critérios propostos para a doença, e ainda na adopção de medidas preventivas nos membros da família dos pacientes afectados. Neste trabalho foi proposta a optimização, para cada gene responsável pela DAVD, da amplificação das regiões de interesse individualmente, através de reacções de PCR simples e, posteriormente amplificar, na mesma reacção, vários exões simultaneamente utilizando a PCR multiplex. Uma vez que não existem quaisquer registos publicados sobre o estudo molecular da DAVD em Portugal, pretendeu-se neste trabalho fazer o rastreio molecular dos genes PKP2, DSP e DSG2, numa amostra de 40 pacientes portugueses com suspeita clínica de DAVD, que desde 2007 deram entrada no IPATIMUP. O rastreio molecular foi efectuado recorrendo à sequenciação directa de todos os exões e regiões intrónicas flanqueantes dos genes em estudo. A optimização das reacções de PCR multiplex reduziu em mais de 80 % o número de reacções a efectuar para cada caso em análise. Na prática implica aproximadamente 1/5 dos gastos em reagentes ao nível da amplificação do DNA, mas também uma significativa redução no tempo de preparação das reacções. Foram identificadas 11 mutações em heterozigotia em 9 pacientes (9/40). Desta forma pode-se dizer que 22,5 % dos pacientes com suspeita clínica amostrados são portadores de mutações nos principais genes associados à doença, e que por isso, o diagnóstico genético permite confirmar a suspeita clínica da doença. O gene PKP2 foi o mais frequentemente mutado entre os pacientes presentes na amostra (90,9 %), com 10 mutações identificadas, seguindo-se o gene DSG2 (9,1 %) com uma mutação. Três das mutações em PKP2 não tinham sido anteriormente descritas. Em nenhum dos pacientes foram identificadas mutações no gene DSP.

Arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy (ARVD/C) is a primary cardiomyopathy that presents an incidence from 1 in 2000 to 1 in 5000 individuals in the general population. However, ARVD/C is an important cause of sudden death in the young and especially in athletes. ARVD/C is a most inherited disease, generally presenting an autosomal dominant pattern of transmission, histologically characterized by fibrofatty replacement of the right ventricular myocardium, and the possible involvement of the left ventricle and the septum in late stages. Several studies report that mutations in genes coding for desmosomal proteins may prove the disease in 50 % of the patients with ARVD/C. Genetic testing is useful to confirm the clinical diagnosis, particularly in individuals who do not completely fulfil Task Force criteria for the disease, thereby also enabling the adoption of preventive measures in family members. In this work it was proposed the optimization, of target regions amplification for each gene related to the disease, using simple PCR, and later the amplification, of several exons simultaneously in the same reaction, using PCR multiplex. Since there are no published data about ARVD/C molecular studies in Portugal, this study also pretends to make a molecular screening of the 3 most important desmosomal genes related with ARVD/C: PKP2, DSP and DSG2, in a sample of 40 Portuguese patients with clinical suspicion of ARVC/D, that since 2007 entered in IPATIMUP. Mutation screening was performed by direct sequencing technique of all exons and flanking intronic regions of the target genes. The optimization of multiplex PCR reactions reduced the total number of reactions in more than 80%. Implying in practice 1/5 of the costs of reagents related with amplification, but also a significant reduction in the time to prepare the reactions. Eleven heterozygous mutations were detected in 9 patients (9/40). Consequently, 22.5 % of the patients with clinical suspicious of ARVD/C presented mutations in the 3 most important desmosomal genes related with ARVD/Cand therefore, the molecular diagnostic may confirm the clinical suspicion of the disease in these cases. The most frequently mutated gene was PKP2 (90.9 %), with 10 mutations found, followed by DSG2 (9.1 %) with just 1 screened mutation. Three of the 10 detected mutations in PKP2 gene were novel. The screened patients didn’t present any mutations in DSP gene.