Functional characterisation of HZF and LZF genes in heat stress response of Arabidopsis thaliana

Abstract

Superior plants are well adapted to the environmental perturbations they are inevitably exposed to. Heat stressful conditions are often responsible for the reallocation of the metabolic processes in tolerant plants. Understanding how plants perceive high temperatures and coordinate cellular growth in response to heat stress is essential to surpass the potential negative effects and significant crops yield reduction. HZF is gene encoding a C3H2C3-type RING (Really Interesting New Gene) zinc finger protein, proposed to be a heat response determinant in Arabidopsis thaliana. HZF loss-of-function causes a delay in the germination process under heat stress conditions, suggesting that this gene might be important for the extension of the dormancy period or the inhibition of the germination triggering. RING finger proteins are sometimes found in dimmers of redundant pairs of RING-type E3 ubiquitin ligases. A highly homologous gene to HZF (LZF), also encoding for a RING finger protein, has been proposed to have a redundant function to HZF in standard environmental conditions. In silico analysis of both HZF and LZF revealed that the expression of both genes might be influenced by abscisic acid (ABA), which suggests that HZF-LZF regulation might play a role in ABA signalling during germination. The present work gives new perspectives on how the acquisition of thermotolerance might depend on HZF expression. Following the bioinformatic analyses, which strongly suggested similar regulation profiles for HZF and LZF, the functional characterisation of loss-of-function and overexpression mutant lines for these genes was initiated. HZF and LZF appear to be both heat-responsive but only HZF seems to be important at the onset of seed germination under heat stress conditions. However, in what concerns to ABA hormonal regulation, both genes seem to play an important role. HZF and LZF gene expression analyses revealed positive feedback loops between one another, further supporting the coregulation hypothesis. The examination of transgenic plants containing the GUS reporter gene under the control of HZF native promoter has corroborated its involvement in heat responses and implicated HZF in ABA and auxin-dependent root development events. The subcellular localisation by fluorescent imaging of the HZF product suggests that it could be directed to structures that control the plant cell expansion. To better understand the mechanisms underlying HZF role in the processes that it could be involved, the HZF recombinant protein has been expressed in the E. coli heterologous systems. The recombinant HZF protein could be used in future biochemical assays, for assessing the putative the ubiquitin-ligase activity. Although far from being elucidated, the results obtained in this work contributed for a better understanding of HZF and LZF role on heat stress responses and other physiological processes.

As plantas superiores são organismos bem adaptados às perturbações ambientais a que estão inevitavelmente expostas. De modo a evitar os potenciais efeitos negativos do stresse térmico, o qual afecta frequentemente o rendimento de plantas de cultivo, é essencial perceber o modo como as temperaturas elevadas são percepcionadas pelas plantas e como estas coordenam o crescimento celular em resposta a este estímulo. O gene HZF codifica uma proteína do tipo C3H2C3 RING (Really Interesting New Gene) zinc finger, tendo sido proposto como um determinante genético na resposta de Arabidopsis thaliana a condições de choque térmico. A perda de função de HZF provoca um atraso na germinação da semente em stresse térmico, o que sugere que este gene poderá ser importante na extensão do período de dormência ou no despoletar da germinação da semente. As proteínas RING finger são por vezes encontradas na célula em forma de dímeros de proteínas redundantes envolvidas nas vias de degradação de proteínas dependentes da ubiquitina, funcionando como E3 ligases. Neste contexto, um outro gene que codifica igualmente uma E3 ligase do tipo RING finger e que apresenta uma elevada homologia com HZF (LZF), foi proposto como tendo uma possível função redundante com a de HZF. A análise in silico de HZF e de LZF revelou que a expressão destes poderá ser influenciada pelo ácido abscísico (ABA), o que indica que a regulação HZF-LZF poderá ter um papel relevante na sinalização pelo ABA durante a germinação. O presente trabalho apresenta novas perspectivas sobre o modo como a aquisição de termotolerâcia pela planta pode depender da expressão do gene HZF. Após uma análise bioinformática, em que são sugeridos perfis de regulação semelhantes para HZF e LZF, foi iniciada a caracterização funcional destes dois genes em linhas mutantes e de sobre-expressão. HZF e LZF parecem ambos ser induzidos pelo choque térmico, mas apenas HZF deverá ser importante no despoletar da germinação sob estas condições. Contudo, no que diz respeito à regulação pelo ABA, ambos os genes parecem desempenhar um papel relevante. A análise da expressão destes genes revelou ainda ciclos de feedback positivos entre os dois genes, corroborando a hipótese de co-regulação entre eles. A observação de plantas transgénicas contendo o gene repórter GUS sob controlo do promotor nativo de HZF, não só corrobora o envolvimento da proteína HZF nas respostas ao stresse térmico, como a implica em processos de desenvolvimento da raiz mediados pelo ABA e por auxinas. A localização subcelular do produto de HZF sugere a sua presença em estruturas que controlam os mecanismos de expansão celular. De forma a melhor compreender os mecanismos que suportam o papel do gene HZF nos diferentes processos em que parece estar envolvido, a proteína recombinante HZF foi produzida no sistema heterólogo de E. coli. A proteína recombinante assim produzida poderá ser futuramente usada em ensaios bioquímicos que poderão revelar a sua actividade de ubiquitina-ligase. Apesar de não se encontrarem totalmente elucidados, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para uma melhor compreensão do papel de HZF e LZF nas respostas ao calor e em outros processos fisiológicos.