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https://hdl.handle.net/1822/13190
Título: | Temporal control of vertebrate embryo development: the role of Sonic Hedgehog in somite segmentation |
Autor(es): | Resende, Tatiana |
Orientador(es): | Palmeirim, I. Andrade, Raquel P. |
Data: | 30-Mai-2011 |
Resumo(s): | All vertebrate species present a segmented articulated body, which is easily observed at the
vertebral column level. This segmented nature can be detected quite early during embryonic
development with the periodic formation of repeated segments, the somites, along the anteriorposterior
embryo body axis. These are formed as blocks of cells that bud off from the rostral tip of
the mesenchymal presomitic mesoderm (PSM), which flanks the embryo midline structures,
notochord and neural tube. Somites will later originate all segmented structures of the adult body
such as vertebrae, intervertebral disks, ribs, the dermis of the back and all skeletal muscles, except
those of the head.
Somitogenesis occurs in a highly controlled and coordinated fashion and both the number of
somites and the periodicity with which they are formed are constant and species specific. In the
trunk region of the chick embryo a new pair of somites is formed every 90min. Underlying somite
segmentation periodicity is an intrinsic molecular oscillator designated segmentation molecular
clock. It was first described in the chick embryo with the demonstration of hairy1 cyclic
expression in the PSM with a periodicity of 90min, which corresponds to the time required to form
a pair of somites in the chick. It is now known that several genes belonging to distinct signaling
pathways such as Notch, Wnt and Fgf present a similar oscillatory behavior. Periodic gene
transcription has been described to occur in other vertebrates, other tissues and also in cultured
cells. This suggests that the molecular events underlying somitogenesis are highly conserved and
that gene oscillations may be a widespread mechanism experienced by many cells and tissue types.
A second molecular regulation has been described to account for period somite formation, the
wavefront of differentiation. PSM maturation is defined by two opposing gradients with crossregulatory
activities: high Fgf/Wnt levels maintain the posterior PSM in an undetermined state and
are counteracted by an anterior gradient of Retinoic Acid (RA). The confrontation between these
opposing gradients and the molecular clock oscillations regulates somite formation in the anterior
PSM. Thus, although the molecular clock operates along the entire PSM, only its anterior third is
determined to form somites. Within this PSM region, only the medial-most PSM (M-PSM)
possess intrinsic information for both somite formation and molecular clock gene expression,
suggesting that M-PSM and lateral PSM (L-PSM) cells are differently committed to segment.
Both somite formation and somitogenesis molecular clock are thought to operate
independently of the embryo midline structures, notochord and neural tube, and the signaling
molecules produced therein, namely Sonic hedgehog (Shh). Shh is the most studied member of the
Hedgehog family, which has been implicated in several mechanisms during embryo development but has never been associated with somitogenesis regulation. However, quail/chick grafting
experiments have suggested that the midline structures regulate symmetrical bilateral somite
formation. Moreover, Shh knock-out mice lack the entire vertebrate column except for five to six
ribs.
In the present study, we have investigated the role of midline derived Shh in somitogenesis
regulation. We show that chick PSM cells express both Shh receptors smoothened and patched,
enabling them to respond to notochord-derived Shh. Upon notochord ablation, we observe a delay
in somite formation accompanied by an increased period of the molecular clock oscillations. These
alterations are recapitulated by Shh chemical inhibitors and rescued by an exogenous Shh source,
indicating that Shh is the notochord-derived signal responsible for those perturbations.
Segmentation rate recovers over time, accompanied by raldh2 overexpression. Accordingly,
external RA supply rescues somite formation. Shh absence leads to an upregulation in the PSM of
its downstream effectors, the Glis, in a repressor form and RA is thought to counteract their
activity. We have also addressed the role of Shh in the differential specification of M- and LPSM.
We show that a diffusible signal travels along the M-L anterior PSM axis and that Shh
pathway is responsible for the recruitment of lateral cells by medial ones for timely somite
formation. Quail/chick grafts experiments indicate that prospective L-PSM can be re-specified into
a medial fate when placed into a PM-PSM position and we suggest that this is also mediated by
Shh. A model for Shh activity during PSM specification and somitogenesis, as well as interactions
with the diverse pathways operating in the PSM is proposed. Altogether, the results presented here
provide concluding evidence that Shh signaling is a component of the intricate molecular
machinery responsible for temporal control of somite formation, implicating this molecule in the
somitogenesis machinery for the first time. Os vertebrados são animais segmentados, o que é evidenciado cedo no desenvolvimento embrionário com o aparecimento de estruturas metaméricas, os sómitos, ao longo do eixo anteriorposterior do embrião. Estes formam-se periodicamente como blocos de células a partir da parte rostral da mesoderme pré-somítica (MPS), que surge como duas bandas de tecido mesenquimatoso a ladear as estruturas axiais do embrião, a notocorda e o tubo neural. Os sómitos originam todas as estruturas segmentadas presentes no animal adulto: vértebras, discos intervertebrais, costelas, a derme das costas e todos os músculos esqueléticos do tronco e membros. A somitogénese é um processo coordenado e tanto o número total de sómitos como o tempo necessário para a formação de cada par é constante e específico de cada espécie. Na região do tronco da galinha, um novo par de sómitos é formado a cada 90min. A regular a surpreendente periodicidade da formação de sómitos está o relógio molecular da segmentação, que foi primeiramente descrito em galinha aquando da observação de que o gene hairy1 apresenta um padrão de expressão cíclico. Este tem uma periodicidade de 90min, o que corresponde ao tempo necessário para se formar um novo par de sómitos na galinha. Actualmente sabe-se que diversos genes pertencentes a vias de sinalização como Notch, Wnt e Fgf apresentam também comportamento oscilatório. Esta transcrição periódica foi igualmente descrita noutros vertebrados, noutros tecidos e em linhas celulares, sugerindo que os mecanismos moleculares subjacentes à somitogénese são conservados e que este comportamento oscilatório pode ser um evento generalizado, ocorrendo em diferentes células e tecidos. A formação periódica de sómitos é também regulada por uma frente de maturação observada na MPS e definida por dois gradientes opostos: a MPS posterior é mantida num estado indiferenciado por elevados níveis de Fgf/Wnt, que são contrapostos por um gradiente anterior de ácido retinóico (AR). O confronto entre este gradiente de maturação e as oscilações do relógio regulam a formação de sómitos na MPS anterior. Deste modo, apesar de o relógio da somitogénese estar activo em toda a MPS, apenas a sua porção anterior está determinada para segmentar. Nesta região, verifou-se também que apenas a porção mais mediana da MPS (M-MPS) contém informação intrínseca para a formação de sómitos e a expressão de genes do relógio, o que sugere que a MPS-M e a MPS lateral (MPS-L) são diferentes no que diz respeito à sua capacidade de segmentação. Considera-se que tanto a formação de sómitos como o relógio molecular são processos independentes das estruturas axiais do embrião, a notocorda e o tubo neural, e das moléculas sinalizadoras aí produzidas, nomeadamente Sonic hedgehog (Shh). Esta faz parte da família de proteínas Hedgehog envolvida na regulação de diversos processos embrionários, mas que nunca foi implicada na somitogénese. Contudo, experiências usando quimeras codorniz/galinha indicam que as estruturas axiais regulam a formação bilateral e simétrica dos sómitos. Na verdade, nos ratinhos mutantes para Shh a coluna vertebral está ausente, apresentando apenas cinco a seis costelas. Com este trabalho pretendeu-se estudar o papel de Shh proveniente das estruturas axiais na regulação da somitogénese. A análise da expressão dos receptores de Shh smoothened e patched indica que a MPS está apta para responder à sinalização de Shh vinda da notocorda. Após remoção da notocorda, verificou-se um atraso na formação periódica de sómitos, que foi acompanhado por um aumento na periodicidade das oscilações moleculares. Foi possível recapitular estas alterações usando inibidores de Shh e restaurá-las com a adição de Shh, sugerindo que esta molécula é responsável pelas perturbações observadas após ablação da notocorda. Verifica-se que a periodicidade de formação de sómitos é recuperada ao longo do tempo, ao mesmo tempo que se observa uma sobre-expressão de raldh2. De facto, a adição de AR exógeno permite a recuperação da formação de sómitos. Na ausência de Shh, há um aumento da expressão na PSM dos seus efectores moleculares, os Glis, na sua forma repressora e pensa-se que o AR inibe a sua actividade. O papel de Shh na especificação da MPS M e L foi também avaliado. Verificámos a existência de um sinal difusível que percorre a MPS anterior ao longo do seu eixo M-L e mostramos que Shh é responsável pelo recrutamento de células laterais da MPS para integrar o sómito em formação. Para além disso, o uso de quimeras codorniz/galinha permitiu verificar que o território L da MPS prospectiva adquire um destino mediano quando posicionado na região M prospectiva, o que provavelmente se deve também a Shh. Apresentamos um modelo explicativo da actividade de Shh durante a especificação da MPS e na somitogénese e também da sua interacção com outras moléculas sinalizadoras que actuam na MPS. Os resultados aqui apresentados levam-nos a concluir que Shh é um componente adicional da complexa rede molecular subjacente ao controlo temporal da formação de sómitos, implicando esta via de sinalização na somitogénese pela primeira vez. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Ciências da Saúde |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/13190 |
Acesso: | Acesso aberto |
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