Development of carrier systems for the controlled release of interleukin-10

Abstract

Therapeutic proteins are becoming available for the treatment of a wide range of diseases. A main problem limiting the efficiency of protein therapeutics is the reduced stability and short circulation half-lives after parenteral administration. Interleukin-10 (IL-10) is an anti-inflammatory cytokine, which active form is a noncovalent homodimer with two intramolecular disulphide bonds essential for its biological activity. Due to its immunoregulatory properties, IL-10 is a promising protein to be used in several clinical applications. So, it is essential to develop delivery systems that enhance the protein bioavailability and selectivity, and that enables a targeted controlled release profile. This is the main focus of the present thesis, taking IL-10 as case study. The use of Carbohydrate-Binding Modules (CBM) as a tool for protein delivery and functionalization was attempted. Proteins and peptides can be used to functionalize biomaterials used for tissue engineering or other biomedical applications, for instance to reduce inflammation (in case of IL-10) or to enhance cellular adhesion (RGD peptide). A method based on the use of a human chitin-binding module, with affinity for chitin, was tested as an alternative approach to the chemical grafting of bioactive proteins/peptides (Chapter 2) on chitin-based biomaterials. A fusion recombinant protein, containing the RGD sequence fused to a human chitin-binding module, was produced and its ability to enhance fibroblasts adhesion to reacetylated chitosan films was tested. The results show that the recombinant protein inhibits the fibroblasts adhesion and proliferation. It was also concluded that the toxic effect was mainly due to the human-chitin biding module. Several polymer protein delivery systems have been developed and described in the literature. Among them, nanometer-sized polymer hydrogels (nanogels) have attracted growing interest. By trapping proteins in a hydrated polymer-network, nanogels minimize denaturation, simultaneously allowing a slow, continuous and controlled release, ideally maintaining an effective concentration for the necessary period of time. A mutated form of murine IL-10 (rIL-10) was successfully produced and its biological activity was confirmed on endotoxin-stimulated bone marrowderived macrophages (Chapter 3). It was shown that a dextrin nanogel (previously developed) effectively incorporated, stabilized, and enabled the slow release, in vitro, of biologically active rIL-10 over time. The IL-10 delivery system based on dextrin nanogels was further analyzed (Chapter 4). Dextrin nanogels were shown to be biocompatible and, after subcutaneous injection, allowed a stable concentration of rIL-10 for at least 4 hours. Despite the low amount of rIL-10 released from the complex nanogel/rIL-10, the rIL-10 released was biologically active in vivo, in the mice. A composite hydrogel made of oxidized dextrin hydrogel with incorporated dextrin nanogels was developed (Chapter 5). The oxidized dextrin hydrogel presented acceptable mechanical properties, biocompatiblity and biodegradability. Additionally, it allowed for the controlled release of the dextrin nanogels. The dextrin nanogel permitted the incorporation of rIL-10, curcumin and β-galatosidase into the oxidized dextrin hydrogel and allowed for their release over time. In all assays, rIL-10 showed high instability and it is likely that a different release profile from either dextrin nanogel or oxidized dextrin hydrogel could be achieved using other kind of bioactive molecules. So, further studies with other bioactive and more stable proteins should be attempted in order to evaluate the potential of the dextrin nanogel and oxidized dextrin hydrogel as protein delivery systems. Even though, considering the interesting properties of dextrin, the stabilization of rIL-10 by the dextrin nanogels as well as the controlled release rate achieved with the composite hydrogel, we consider as very promising the described systems for protein delivery applications.

As proteínas terapêuticas representam uma nova classe de fármacos para o tratamento de diversas doenças. Um dos principais problemas é a estabilidade reduzida e consequentemente o curto tempo de semi-vida das mesmas, após administração parenteral. A interleucina 10 (IL-10) é uma citocina anti-inflamatória, cuja forma activa é composta por um homodímero com duas ligações intramoleculares dissulfureto, que são essenciais para a sua actividade biológica. Devido às suas propriedades imunoreguladoras, a IL-10 apresenta grandes potencialidades em diversas aplicações clínicas. Portanto, é essencial o desenvolvimento de sistemas que permitam não só a libertação controlada da proteína mas também aumentem a biodisponibilidade da mesma. Este é o objectivo principal desta tese. Um domínio de ligação a carbohidratos (CBM) foi usado como ferramenta para veicular proteínas e funcionalizar biomateriais. As proteínas e péptidos podem ser usados para funcionalizar biomateriais, por exemplo exercendo actividade antiinflamatória (IL-10) ou aumentando a adesão celular (péptido RGD). Um método baseado no uso de domínio de ligação à quitina foi utilizado neste trabalho como alternativa ao enxerto químico de proteínas ou péptidos (Chaper 2) em biomateriais de quitina. Foi produzida e testada a capacidade de uma proteína recombinante de fusão, contendo uma sequência RGD fundida com um domínio humano de ligação a quitina, no aumento da adesão de fibroblastos a filmes de quitosano reacetilado. Os resultados mostram que as proteínas recombinantes afectam negativamente os fibroblastos, inibindo a sua adesão e proliferação. Concluiu-se também que este efeito negativo se deve, essencialmente, ao domínio humano de ligação à quitina. Diversos sistemas de libertação baseados em polímeros têm sido desenvolvidos e descritos na literatura. Entre eles, os hidrogéis de tamanho nanométrico (nanogéis) têm atraído muito interesse. Incorporando as proteínas numa rede hidratada, os nanogéis minimizam a desnaturação, e simultaneamente permitem uma libertação lenta, contínua e controlada, mantendo uma concentração efectiva da proteína pelo tempo necessário. Uma forma mutada de IL-10 (rIL-10) de ratinho foi produzida com sucesso e a sua actividade biológica confirmada em macrófagos derivados de medula óssea activados (Chapter 3). Demonstrou-se que um nanogel de dextrino (desenvolvido anteriormente) foi capaz de efectivamente incorporar e estabilizar proteína, possibilitando a libertação controlada, in vitro, de rIL-10 biologicamente activa. Os nanogéis como sistema controlado de libertação de IL-10 foram caracterizados detalhadamente (Chapter 4). Os nanogéis são biocompatíveis e, após injecção subcutânea, permitiram que fosse mantida uma concentração estável de IL-10 pelo menos por 4 horas. Apesar das baixas quantidades de rIL-10 libertada do nanogel, a rIL-10 livre é biologicamente activa in vivo, em ratinhos. Foi também desenvolvido um biomaterial composto por um hidrogel de dextrino oxidado com incorporação de nanogéis de dextrino (Chapter 5). O hidrogel de dextrino oxidado apresenta boas propriedades mecânicas, é biocompatível e biodegradável. Adicionalmente, foi verificada a libertação controlada dos nanogéis de dextrino incorporados. O nanogel permitiu a incorporação no hidrogel de dextrino oxidado de rIL-10, curcumina e β-galatosidase e verificou-se a sua libertação ao longo do tempo. Em todos os ensaios foi verificada uma elevada instabilidade da rIL-10 e é provável que usando outro tipo de moléculas bioactivas seja possível obter um perfil de libertação diferente, tanto dos nanogéis de dextrino como dos hidrogéis de dextrino oxidado. Portanto, de forma a avaliar as potencialidades dos sistemas descritos para a libertação de proteínas, mais estudos deverão ser feitos com proteínas bioactivas mais estáveis. Considerando as propriedades do dextrino, interessantes do ponto de vista do desenvolvimento de aplicações biomédicas, a estabilização da rIL-10 pelos nanogéis assim como a libertação controlada observada nos hidrogéis compostos, podem classificar-se de muito promissores os sistemas descritos para a libertação de proteínas.