Aconitase as a target of fragmentation during oxidative stress induced apoptosis in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

It is nowadays consensual that yeast Saccharomyces cerevisiae has the basic molecular machinery needed to undergo cell death, with an apoptotic phenotype upon a wide range of external or physiological stimuli. Since the discovery of yeast metacaspase, Yca1p, a metacaspase-dependent apoptotic pathway has been revealed. However, despite the efforts to uncover the mechanisms involved in this apoptotic pathway little is known about the events upstream and downstream metacaspase activation. By combining digestome analysis with mass spectrometry analysis and in vivo assays, yeast aconitase-1 (Aco1p) has been identified as a target of Yca1p mediated fragmentation during hydrogen peroxide induced apoptosis. Additionally, our results demonstrate that yeast wild type cells present resistance to H2O2-induced apoptosis in the presence of fluoracetic acid, a specific inhibitor of aconitase enzymatic activity in the tricarboxylic acid cycle. Nevertheless, results suggest that, inhibition of Aco1p function in the maintenance of mtDNA, promoted by its Yca1p fragmentation, might be the greater contributor for H2O2-induced apoptosis. Furthermore, results indicate that aconitase is necessary for GAPDH cleavage in total cellular extracts and that mitochondrial localized GAPDH is not cleaved by Yca1p. Aconitase cleavage does not appear to influence the NO levels produced during H2O2-induced apoptosis. Altogether the results indicate that Aco1p is a target of Yca1p fragmentation during H2O2- induced apoptosis, and a link between its cleavage and aconitase functions impairment is suggested particularly in what concerns Aco1p function in mtDNA maintenance. However the exact mechanisms underlying Aco1p involvement in H2O2-induced apoptotic cell death remain to be elucidated.

Actualmente é consensual que a levedura, Saccharomyces cerevisiae possui o mecanismo molecular básico necessário para a ocorrência de morte celular programada, com características apoptóticas. A descoberta da metacaspase em levedura, Yca1p, evidenciou a existência de uma via apoptótica dependente da metacaspase e activada por diversos estímulos apoptóticos. No entanto, apesar da contínua descoberta dos mecanismos e vias envolvidos neste processo apoptótico, pouco se conhece em relação à hierarquia dos eventos compreendidos. Através da combinação da análise de digestoma com análises por espectrometria de massa e ensaios in vivo, a aconitase-1 (Aco1p) foi identificada como alvo de fragmentação pela Yca1p, durante a apoptose induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2). Adicionalmente, os resultados demonstram que células da estirpe selvagem apresentam resistência à apoptose induzida por H2O2 quando incubadas com ácido fluoracético, um inibidor específico da actividade enzimática da Aco1p no ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Os resultados sugerem, ainda, que a clivagem da Aco1p pela Yca1p durante a apoptose induzida por H2O2 leva a uma inibição da função da Aco1p em relação à manutenção do mtDNA, contribuindo para o processo apoptótico. Por outro lado, a fragmentação da GAPDH, mediada pela Yca1p, em extractos totais parece estar dependente da presença da Aco1p, como revelado pelos resultados obtidos com o mutante, e demonstram que a GAPDH localizada na mitocôndria não é alvo de fragmentação pela Yca1p. Adicionalmente, a clivagem de aconitase pela Yca1p, durante a apoptose induzida por H2O2 parece não interferir com os níveis de NO produzidos durante o processo apoptótico. Os resultados aqui presentes, demonstram que a Aco1p é alvo de fragmentação pela Yca1p durante a apoptose induzida por H2O2 e sugerem que esta clivagem leva a alterações nas funções da Aco1p, nomeadamente no que diz respeito à manutenção do mtDNA. No entanto, os mecanismos exactos subjacentes ao envolvimento da Aco1p na morte celular apoptótica induzida por H2O2 continuam por esclarecer.