Exploitation of natural eumelanin and conductive polymers on the preparation of electroactive systems for skeletal muscle tissue engineering applications

Abstract

Skeletal muscle tissues comprise about 40-45% of the total human body mass. The skeletal muscle functionality is commonly depreciated as a consequence of congenital abnormalities, traumatic injuries from accidents or sports activities, and neurological diseases. The defects in muscle structure can affect the physiological performance of the body as a whole, which further influences the psychological responses. It has been demonstrated that electrical stimulus can affect cell behavior, namely, adhesion, proliferation and differentiation and accelerate the healing of damaged tissues like bone and nerves. Moreover, electrical stimulation is one of the emerging tools being used in clinics with the purpose of inducing and recovering the physiological functionality in damaged muscle tissues. However, the clinical outcomes are limited to the specific local area, such as head, legs, arms and back. Despite the intrinsic capacity of skeletal muscle tissues to self-repair, in case of severe tissue damage or loss, such capacity is insufficient to restore the functionality. The conventional clinical treatment modalities include allocation of autologous muscle by surgical treatment, but clinical outcomes are not very satisfactory. Thus, by combining the advantages of electrical stimulus, including cell fate modulation, with electroactive materials and tissue engineering approaches, we expect to overcome some of the existing limitations. Indeed, skeletal muscle tissue engineering holds great potential to alleviate the increasing burden of defective muscle tissues by constructing viable substitutes for replacement therapies. Nevertheless, the reconstruction of tissue engineered skeletal muscle substitutes should mimic native skeletal muscle-like structural properties including myofibers uniformity and density throughout the functional muscle cells. This thesis is focus on the exploitation of novel biomaterials, in particular, natural and synthetic polymers, with electrical properties, for skeletal muscle tissue engineering applications. Eumelanin from Sepia ink (Sepia officinalis) was initially purified by a well-established protocol and analyzed by colorimetric oxidative assay for investigating the redox activity. To explore intrinsic properties of eumelanin nanoparticles and expand its applications, an innovative approach was developed, which consisted in the preparation of electrospun PVA nanofibers meshes containing eumelanin nanoparticles. The physical properties, in particular, electrical conductivity, and biological performance of the nanofibrous meshes were significantly improved upon eumelanin incorporation, indicating that EUNp-PVA nanofibrous matrices are excellent candidates to be used in skeletal muscle tissue engineering applications. In parallel, novel electroactive spongy-like hydrogels were developed by combining gellan gum (GG) with two different conductive synthetic polymers: polypyrrole (PPy) and polyaniline (PANi). GG is a linear anionic polysaccharide of natural origin that has been extensively studied for a wide range of biomedical applications and can be transformed in a hydrogel at body temperature by ionic crosslinking. When processed as spongy-like hydrogels, these materials retain the structural features of hydrogels relevant for tissue engineering applications and improved mechanical and cell adhesive properties. Thus, the rationale behind adding synthetic conducting polymers, PPy and PANi, was to improve the electroconductive properties of the final constructs, maintaining simultaneously the improved mechanical features and intrinsic cell-adhesive ability of GG spongy-like hydrogels. The physical, chemical and electrical properties were analyzed, and cytotoxicity, as well as, biocompatibility was assessed both in vitro and in vivo. Both PPy-GG and PANi-GG electroactive spongy-like hydrogels have shown high porosity and interconnected pores, showing enhanced cellular response during in vitro studies. Moreover, negligible inflammatory response was observed during in vivo analysis. The results demonstrate that the electroactive PPy-GG and PANi-GG spongy-like hydrogels meet all the functional requirements for mimicking the ECM microenvironment of muscle tissue, being interesting candidates to be used in skeletal muscle tissue regeneration strategies. The results reported in this thesis demonstrate the successful fabrication of eumelanin nanoparticlesincorporated PVA nanofibrous meshes by electrospinning, as well as, the production of electroactive PPy-GG and PANi-GG spongy-like hydrogels. Furthermore, physicochemical and biological assessment of these three different matrices prove that these biomaterials have beneficial properties to be employed in the development of tissue engineering strategies for the regeneration of skeletal muscle tissues or other tissues of interest that respond favorably to electrical stimulation.

O tecido muscular esquelético constituí cerca de 40-45% da massa total do corpo humano. A funcionalidade do tecido muscular esquelético é frequentemente comprometida como consequência de anomalias congénitas, lesões traumáticas decorrentes de acidentes ou atividades desportivas e doenças neurológicas. Os defeitos no músculo-esquelético podem afetar o desempenho fisiológico do corpo, influenciando as suas respostas fisiológicas. Foi demonstrado que o estímulo elétrico pode afetar a comportamento celular, nomeadamente a adesão, proliferação e diferenciação, e acelerar a cura dos tecidos danificados como os ossos e os nervos. Apesar da estimulação elétrica ser uma ferramenta emergente usada na prática clínica com o objetivo de induzir e recuperar a funcionalidade fisiológica dos tecidos danificados, os resultados clínicos são limitados a uma área específica como cabeça, perna, braço e costas. Apesar da capacidade intrínseca do músculo-esquelético para auto-reparação, em casos de danos severos ou perda do tecido, essa capacidade é insuficiente para restaurar a funcionalidade do músculo. As modalidades de tratamento clínico convencionais incluem alocação de músculo autólogo por tratamento cirúrgico, no entanto, os resultados clínicos não são muito satisfatórios. Assim, através da combinação das vantagens do estímulo elétrico com materiais electrocondutores e engenharia de tecidos, pretendemos ultrapassar algumas das limitações existentes na regeneração do músculoesquelético. De facto, a engenharia de tecidos do músculo-esquelético apresenta grande potencial para reduzir a elevada percentagem de tecidos musculares defeituosos através da construção de substitutos viáveis para terapias de reposição. No entanto, a reconstrução do tecido fabricado pela engenharia de tecidos deve simular o tecido muscular nativo nas suas propriedades estruturais, incluindo a uniformidade e densidade das células musculares. Esta tese foca-se na exploração de novos biomateriais, em particular, polímeros materiais e sintéticos, com propriedades elétricas, para a engenharia de tecido muscular esquelético. A eumelaninn da Sepia ink (Sepia officinalis) foi inicialmente purificada por um protocolo estabelecido e analisada por um ensaio colorimétrico oxidativo para investigar as suas propriedades oxidativas/redutoras. Para explorar as propriedades intrínsecas das nanopartículas de eumelanina e alargar as suas aplicações, uma nova abordagem foi desenvolvida, que consistiu na preparação de nanofibras de PVA por “electrospun” contendo na malha das fibras nanopartículas de eumelanina. As propriedades físicas, em particular a condutividade e o desempenho biológico das malhas de nanofibras foram melhoradas significativamente após a incorporação de eumelanina, indicando que as matrizes de nanofibras de eumelanina nanopartícula-álcool polivinílico (EUNp-PVA) são excelentes para serem usadas em engenharia de tecidos do tecido muscular esquelético. Em paralelo, novos hidrogéis “spongy-like” foram desenvolvidos com gellan gum (GG) com dois polímeros condutores diferentes: polypyrrole (PPy) e polianilina (PANi). Gellan gum é um polissacarídeo aniónico linear cuja origem natural tem sido intensamente estudada para vasto número de aplicações biomédicas, que pode ser transformado num hidrogel à temperatura do corpo por reticulação iónica. Quando processado como um “spongy-like” hidrogel, retém as estruturas estruturais dos hidrogéis relevantes para engenharia de tecidos e melhoram as propriedades mecânicas e de adesão das células. Assim, o objetivo de adicionar polímeros condutores sintéticos, PPy and PANi, foi o de melhorar as propriedades electrocondutoras dos construtos finais, mantendo simultaneamente as características mecânicas e de adesão celular dos “spongy-like” GG hidrogéis. As propriedades físicas, químicas e elétricas foram analisadas, e a citoxicidade, assim como a biocompatibilidade foi avaliada in vitro e in vivo. Ambos “spongy-like” hidrogéis PPy-GG e PANi-GG apresentam grande porosidade e poros interconectados. Demonstrando assim melhor resposta celular durante os estudos in vitro. No entanto, inflamação celular não significativa foi detetada durante os estudos in vivo. Os resultados demonstram que os hidrogéis eletroactivos “spongy-like” PPy-GG e PANi-GG preenchem todos os requisitos funcionais para substituir a matriz extracelular (ECM) do tecido muscular, sendo candidatos interessantes para serem utilizados nas estratégias de regeneração do tecido muscular esquelético. Os resultados desta tese demostram a fabricação de nanopartículas de eumelanin e a sua incorparação em malhas de nanofibras à base de PVA produzidas por electrospinning, assim como a produção de hidrogéis “spongy-like” condutores. A avaliação físico-química e biológica destas 3 matrizes diferentes prova que estes biomateriais têm propriedades beneficiais para serem utilizados no desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecidos para a regeneração do músculo esquelético ou outros tecidos de interesse que respondem favoravelmente à estimulação elétrica.