Elucidation of drug induced cell death mechanisms through functional characterization of vacuoles by fluorescence techniques and biochemical approaches

Abstract

The yeast Saccharomyces cerevisiae can undergo a regulated cell death in response to acetic acid treatment. Different events are triggered by acetic acid, mainly at the mitochondria, like cytochrome c release and ROS accumulation, and at the vacuole, such as partial permeabilization of the vacuolar membrane associated with the release of specific proteases. During acetic acid-induced apoptosis the vacuolar protease Pep4p is translocated from the vacuole to the cytosol leading to mitochondrial degradation. Cathepsin D, the human ortholog of the yeast Pep4p, is equally released from the lysosomes to the cytosol upon acetate treatment in colorectal cancer cells. However, the mechanisms underlying the selective permeabilization of vacuolar/lysosomal membrane (VMP or LMP) are still poorly understood. To fill this gap of knowledge, we aimed to identify vacuolar membrane proteins involved in the permeabilization of the yeast vacuole membrane and subsequent release of Pep4p. For this purpose, a set of complementary approaches, including classical biochemistry, molecular biology and analytical methods, such as fluorescence microscopy and flow cytometry, were performed. Specific probes to assess vacuolar pH (CDCFDA), superoxide anion accumulation (DHE and Mitosox), and VMP (CMAC), as well as yeast strains expressing Pep4-mCherry, were used. A screening of yeast mutants allowed the identification of three vacuolar membrane proteins with a potential role in VMP/translocation of Pep4p. These mutants showed increased resistance to acetic acid-induced cell death that was associated with lower ROS accumulation and vacuolar pH alterations. Results shed light on the mechanisms underlying translocation of the vacuolar protease Pep4p to the cytosol and VMP. Moreover, the hints provided by this study can also contribute to unveil the mechanisms underlying mammalian lysosomal membrane permeabilization with potential application in the therapy of colorectal cancer, and of diseases associated with lysosomal-dependent cell death.

A levedura Saccharomyces cerevisiae pode desencandear um processo de morte celular regulada em resposta ao tratamento com ácido acético. O ácido acético desencadeia uma cascata de eventos intracelulares, quer ao nível da mitocôndria, promovendo a libertação do citocromo c e a acumulação de ROS, quer ao nível do vacúolo, induzindo a permeabilização parcial da membrana vacuolar e consequente libertação de proteases específicas. Durante a apoptose induzida por ácido acético, a protease vacuolar Pep4p é translocada do vacúolo para o citosol, conduzindo à degradação mitocondrial. A protease Catepsina D (CatD), o ortólogo humano da Pep4p de levedura, é igualmente libertada dos lisossomas para o citosol após o tratamento de células de cancro colorrectal com acetato. No entanto, os mecanismos subjacentes à permeabilização seletiva da membrana vacuolar/lisossomal (PMV ou PML) encontram-se ainda pouco estudados. Para compreender estes mecanismos, no presente estudo identificámos proteínas da membrana vacuolar envolvidas na PMV em levedura e posterior libertação da Pep4p, utilizando um conjunto de abordagens complementares, incluindo de bioquímica, de biologia molecular e métodos analíticos, como a microscopia de fluorescência e a citometria de fluxo. Foram utilizadas sondas fluorescentes específicas para a avaliação do pH vacuolar (CDCFDA), da acumulação do anião superóxido (DHE e Mitosox) e da ocorrência de PMV (CMAC), bem como estirpes de levedura a expressar Pep4-mCherry. O screening de mutantes de levedura permitiu a identificação de 3 proteínas da membrana vacuolar com um potencial envolvimento na PMV e na translocação do Pep4p. Estes mutantes revelaram maior resistência à morte celular induzida pelo ácido acético associada a uma menor acumulação de ROS e a uma menor variação do pH vacuolar. Os resultados permitiram estabelecer uma correlação entre a translocação da Pep4p e a ocorrência de PMV. O presente estudo pode assim contribuir para a elucidação dos mecanismos subjacentes à permeabilização da membrana lisossomal de células de mamífero, com potencial aplicação na terapia do cancro colorrectal e de doenças associadas à morte celular dependente do lisossoma.