Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/54788

TitleCharacterization of the nuclear and inner nuclear membrane proteome in mammalian cells
Other titlesCaracterização do proteoma nuclear e da membrana interna nuclear de células de mamífero
Author(s)Lima , Joana Alexandre Teixeira
Advisor(s)Carvalho, Pedro
Preto, Ana
Issue date2017
Abstract(s)The inner nuclear membrane (INM) is a functional sub compartment of the ER, though is quite dissimilar from it. With a very different protein content from the general ER, this compartment’s complete proteome has not been determined. This specificity is largely based on the restrictions enforced by the nuclear pore complex (NPC) for nuclear import of membrane proteins. The best characterised model for this process (diffusion retention model) suggests that the NPC imposes a diffusion barrier to proteins with extralumenal domains larger than 60 90 kDa; and also that the proteins which are indeed trafficked across the pore can then be retained in the INM due to interactions with lamins and/or chromatin, or proteins associated with either of the two. Even though in the last couple decades many advances have been made surrounding this sub compartment, each had a set of restrictions, the biggest one being the reliance on membrane fractionation procedures and detergent extraction based methods to answer the question. In an attempt to overcome these limitations, this project was designed with the aim of establishing a biochemical assay capable of determining the protein composition of the INM of mammalian cells in situ. For that purpose, we chose to employ an engineered ascorbate peroxidase that very efficiently biotinylates proximal proteins named APEX2. By covalently modifying the proteins of this compartment, we simply need to create a total cell extract, from which we can separate these biotinylated proteins in a pull down and analyze them using tandem mass spectrometry. To do so, cell lines expressing APEX2 fused to a nuclear localization signal (NLS) or an INM resident protein, Lamin B receptor (LBR), were generated using different strategies as to control their expression levels, in an attempt to attain a nuclear and nuclear rim specific localization, respectively. Furthermore, the protocol for inducing APEX2’s biotinylation and pull down for mass spectrometry analysis was also tested. Further optimisation is still needed, though we believe this study sets some guidelines for additional studies involving the INM and its intriguing characteristics. Hence, it can be the starting point for more research focusing on other questions surrounding this sub compartment, namely the turnover rates of these proteins and what influences them, the quality control mechanisms employed to preserve the INM’s very particular proteome or the mechanisms of nuclear envelope (NE) reformation and how this INM identity is maintained even in cells that divide employing an open mitosis.
A membrana nuclear interna (INM) é parte integrante do retículo endoplasmático, contudo é bastante distinta dos outros subdomínios deste organelo. Com um conteúdo proteico diferente do restante retículo, o proteoma completo da INM continua por determinar. A especificidade deste proteoma depende em grande parte das restrições impostas pelo poro nuclear no importe nuclear de proteínas de membrana. O modelo mais consensual (modelo de difusão retenção) sugere que o poro nuclear impõe uma barreira de difusão para proteínas com domínios extraluminais que excedem os 60 90 kDa; as proteínas que são efetivamente transportadas pelo poro são também retidas na INM devido a interacções com as lâminas e/ou a cromatina, ou proteínas a elas associadas. Não obstante o progresso das últimas décadas à volta deste subdomínio, cada estudo teve a si associado um conjunto de restrições, talvez as maiores o recurso a técnicas de fracionamento de membranas e métodos baseados em extração com detergentes para responder a esta questão. Num esforço para ultrapassar estas limitações, este projeto foi desenhado com o objetivo de estabelecer um ensaio bioquímico capaz de determinar a composição proteica da membrana nuclear interna de células de mamífero in situ. Para tal, escolheu se usar uma peroxidase de ascorbato especificamente alterada de forma a biotinilar proteínas na sua vizinhança de modo promíscuo, denominada APEX2. Ao modificar de forma covalente as proteínas deste compartimento, há apenas necessidade de criar um extrato celular, de onde é possível separar estas proteínas biotiniladas através de um pull down e, por sua vez, analisá las recorrendo a espectrometria de massa em tandem. Para fazê lo, linhas celulares expressando APEX2 ligada a um sinal de localização nuclear ou uma proteína residente da INM, como a “Lamin B receptor” (LBR), foram geradas usando diferentes estratégias, numa tentativa de obter uma localização nuclear e perinuclear, respetivamente. Protocolos de indução da biotinilação pela APEX2, de pull down e análise por espectrometria de massa, foram também testados. Otimização adicional é ainda necessária; no entanto acreditamos que este estudo vem estabelecer algumas directrizes para consequentes investigações envolvendo a INM. Este estudo pode ser o ponto de partida para outros ensaios sobre este subdomínio, nomeadamente sobre as taxas de turnover das suas proteínas, e os fatores que as governam, ou ainda os mecanismos de controlo envolvidos na preservação deste proteoma peculiar.
TypemasterThesis
DescriptionDissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biomedicina)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/54788
AccessrestrictedAccess
Appears in Collections:CDQuim - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses
BUM - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
JoanaLima2017_FINAL.pdf4,75 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy!

Partilhe no FacebookPartilhe no TwitterPartilhe no DeliciousPartilhe no LinkedInPartilhe no DiggAdicionar ao Google BookmarksPartilhe no MySpacePartilhe no Orkut
Exporte no formato BibTex mendeley Exporte no formato Endnote Adicione ao seu Currículo DeGóis