Characterization of the relationship between the GPCR Smoothened and the RNA-binding protein SMAUG in Drosophila melanogaster: regulation by HH signalling

Abstract

The conserved Hedgehog signalling pathway is central to embryogenesis and adult tissue homeostasis in metazoans, e.g. Drosophila melanogaster and vertebrates. Hedgehog (HH) acts as a morphogen regulating different cell fates depending on its concentration. HH transduction cascade is tightly regulated, and deregulation of HH signalling activity accounts for congenital diseases, carcinogenesis, neurological disorders and cardiovascular pathologies in humans. SMO, an oncogene of the GPCR family, is paramount to the transduction of the HH signal. In response to HH reception, SMO undergoes extensive phosphorylation, which controls its trafficking, leading to its accumulation at the plasma membrane in drosophila and in the primary cilium in vertebrates. By proteomic and genetic screens, the team “Development, Signalisation and Traffic” directed by Anne Plessis at the Institut Jacques Monod (IJM) identified a novel partner of SMO: the RNA binding protein SMAUG. SMAUG is a key component of mRNA storage bodies where it controls the degradation and translation of many mRNA during fly embryonic development. Their data indicated SMAUG may both act as a positive regulator of HH signaling and be regulated by HH signaling. My goals were (i) to further characterize the interaction between SMO and Smaug, (ii) to analyze their colocalisation in fly cells (iii) to understand better its potential role in HH signaling during wing morphogenesis. Using a combination of molecular, cellular and genetic approaches, I (i) confirmed the colocalisation of SMO and SMAUG, and showed that it was due to their direct interaction, (ii) analyzed the implication of known phosphosites of SMO in the regulation of its interaction with SMAUG, and initiated the search for the kinases that were involved in the regulation of SMO/SMAUG interaction. Finally, my in vivo studies on the role of SMAUG revealed a synthetic lethal interaction with a mutant affecting HH signaling but the interpretation of their results remains unclear. Altogether my data have brought novel information on this unexpected relationship which shed novel light on the function and regulation of both SMO and SMAUG.

A conservada via de sinalização Hedgehog (HH) é central durante embriogéneses e homeostasia do tecido adulto em metazoários, e.g. Drosophila melanogaster e vertebrados. HH atua como um fator morfogénico, regulando diferentes destinos celulares, o que depende da sua concentração. A cascata de tradução de HH é fortemente regulada e, desregulação da atividade de sinalização de HH é responsável por doenças congénitas, carcinogénese, desordens neurológicas e patologias cardiovasculares em humanos. Smoothened (SMO), um oncogene da família dos recetores acoplados a proteínas G, é fundamental para a transdução do sinal da via HH. Em resposta à receção de HH, SMO é extensivamente fosforilado, o que controla o seu tráfego, levando à sua acumulação na membrana plasmática em drosófila, e no cílio primário em vertebrados. Através the análises proteómicas e genéticas, a equipa de investigação “Desenvolvimento, Sinalização e Tráfego” dirigida por Anne Plessis no Instituto Jacques Monod (IJM) identificou um novo parceiro de SMO: uma proteína de ligação ao ácido ribonucleico (ARN), Smaug. Smaug é um componente crucial dos corpos de armazenamento de ARN mensageiro (ARNm) onde controla a degradação e a tradução de muitos ARNm durante o desenvolvimento embrionário na mosca. Os dados obtidos pela equipa indicam que SMAUG possa atuar como regulador positivo da sinalização da via HH, e ser regulado pela mesma via. Os meus objetivos foram (i) caraterizar em maior detalhe a interação entre SMO e SMAUG, (ii) analisar a co localização entre as duas proteínas em células de mosca derivadas do disco imaginário da asa (estrutura que dá origem à asa adulta), (iii) de forma a compreender melhor o potencial papel da relação entre as duas proteínas durante a morfogénese da asa. Através da combinação de técnicas moleculares, celulares e genéticas, eu (i) confirmei a co localização de SMO com SMAUG, e mostrei que esta co localização é devida à interação direta entre as duas proteínas, (ii) analisei a implicação de sítios de fosforilação em SMO, descritos na literatura, na regulação da interação de SMO com SMAUG, e iniciei a procura pelas cinases que estão envolvidas na regulação da interação SMO/SMAUG. Finalmente, os meus estudos in vivo sobre o papel de SMAUG revelaram uma interação sintática letal com uma mutação que afeta a via de sinalização de HH. Contudo, a interpretação destes resultados permanece pouco clara. Em conjunto, os meus dados trouxeram informação adicional sobre esta relação inesperada, contribuindo para a compreensão da função e regulação de ambos SMO and SMAUG.