Development of protein-based formulations for topical treatment of keratinaceous appendices

Abstract

Keratinaceous appendices play an important role in the visual aspect of each individual. The chronic exposure of hair, nails and skin to external hazards have a negative impact on their structure. To prevent or revert the impact of such exposure, several cosmetic products have been developed and are now commercialized. Yet the use of cosmetic products is not restricted to this specific application as they are widely used in the adornment of the keratinaceous appendices, mainly for hair coloration. In this thesis, two approaches for the development of new hair cosmetic formulations were tested. Keratin-based particles and two recombinant crystallins were designed and obtained. These were mainly focused on the restoration and improvement of hair mechanical properties. Keratin-based particles composed by keratin (Kx), silk fibroin (SFy) and Poloxamer407 (Pz) (KxSFyPz) were obtained by high pressure homogenization. Particles size ranged between 150 and 250 nm with low polydispersity and a net negative surface, which was partially neutralized by the addition of poloxamer to particles’ formulation. Homogenization process resulted in an increase on the percentage of β-strands. All formulations do not show cytotoxic effect on human keratinocytes (NCTC 2544 cell line). The effects of keratin-based particles over virgin (VH) and overbleached (8xOB) Asian hair, were monitored regarding particles ability to bind to hair fibres and their effect over hair mechanical properties. Keratin-based particles increased hair fiber physically by 62.7% for VH and 83.4% for 8x OB, which was directly related with the quantity of β- strands present in the particle system as well their binding capability. Two crystallin forms, a wild type (CrysWt) and a mutant (CrysMut), based on the sequence of human eye ɣD-Crystallin were expressed in E. coli using a commercial TB-AIM medium. The recombinant crystallins were obtained pure after purification with magnetic beads and the proteins had a molecular weight of 24.8 kDa and 24.6 kDa for wild type and mutant forms, confirmed by MALDI-TOF. Analysis of protein secondary structures revealed that the new crystallins retained the structure of human eye ɣD-Crystallin, which is rich in β-sheets. This type of structure is typical of crystallin which belong to a family of proteins characterized by the presence of the Greek-key motif. Outcome from protein formulation characterization supports the hypothesis that the keratin-based particles were able to recover and improve the mechanical properties of virgin and overbleached hair. Therefore, these particles can be considered as a very promising strengthening safe agent for the development of new restorative hair care products.

Os apêndices queratinosos desempenham um papel importante no aspeto visual de cada indivíduo. A constante exposição a perigos externos para cabelo, unhas e pele tem um impacto negativo na sua estrutura. Para evitar ou reverter o impacto dessa exposição, vários produtos cosméticos foram desenvolvidos e agora são comercializados. No entanto, o uso de produtos cosméticos não é restrito a esta aplicação específica, uma vez que são amplamente utilizados no adorno dos apêndices queratinosos, principalmente para a coloração do cabelo. Nesta tese, foram testadas duas abordagens para o desenvolvimento de uma nova formulação cosmética para o cabelo. Partículas à base de queratina e duas cristalinas recombinantes foram projetadas e obtidas. Estas estratégias distintas são principalmente focadas no restauro e melhoramento das propriedades mecânicas do cabelo. Partículas à base de queratina compostas por queratina (Kx), fibroína de seda (SFy) e Poloxamer (Pz) (KxSFyPz) foram obtidas através de homogeneização de alta pressão. As partículas possuíam tamanho entre 150 e 250 nm com baixa polidispersividade e carga superficial negativa, parcialmente neutralizada pela adição do poloxamer. Nenhuma formulação apresentou efeito citotóxico na linha celular NCTC 2544 de queratinócitos humanos. A capacidade das partículas se ligarem com as fibras e a sua deposição em cabelo virgem (VH) e cabelo descolorado (8xOB) foi analisada. A melhoria das propriedades mecânicas das fibras foi estudada através de testes de tensão. Em cabelo virgem houve um aumento de 62.7% e em cabelo descolorado de 83.4%. Estes aumentos estão diretamente ligados à quantidade de estruturas β- no sistema particulado assim como a capacidade de ligação com a superfície da fibra do cabelo. Os dois tipos de cristalinas, wild type (CrysWT) e mutante (CrysMut), baseadas na sequência da ɣD-Cristalina do olho humano foram expressas em E. coli em meio comercial TBAIM. As cristalinas recombinantes purificadas, obtidas após a purificação com “beads” magnéticas, apresentam peso molecular de 24.8 kDa e 24.6 kDa, para CrysWT e CrysMut respetivamente, confirmados pela técnica de MALDI-TOF. Análise à estrutura secundária destas proteínas puras revelara que estas mantêm uma estrutura rica em folhas β, tal como é característico da estrutura em chave grega desta família de proteínas. O resultado da caracterização da formulação proteica suporta a hipótese de que as partículas foram capazes de recuperar e melhorar as propriedades mecânicas dos cabelos virgens e excessivamente descolorados. Estas podem ser consideradas como um agente de fortalecimento muito promissor e seguro para o desenvolvimento de novos produtos reparadores para cabelo.