Molecular mechanisms underlying the anticancer activity of lactoferrin in highly metastatic cancer cell lines

Abstract

Cancer is currently one the most lethal disease worldwide and metastases remain the main cause of cancer-associated mortality, which reinforces the importance of developing more targeted and efficient cancer therapies. In this sense, lactoferrin (Lf) has emerged as a safe and effective agent in cancer therapy. Lf is a natural iron-binding protein derived from milk that is present in many tissues and biological fluids. Interestingly, it was found that Lf displays anticancer and anti-metastatic activities against several cancer cell lines. However, Lf cellular targets implicated in its mechanisms of action are poorly elucidated, which limits the usage of Lf in cancer therapy. Hence, unveiling the targets of Lf underlying its anticancer activity is of prime relevance and it will be explored in the current work. Recently, results of our group showed that bovine Lf (bLf) is preferentially cytotoxic to highly metastatic breast cancer cells through inhibition of the plasmalemmal proton pump V-ATPase, while exhibiting no effect on non-tumorigenic cells. In the present study, we aim to ascertain whether this same mechanism of action could explain the anticancer/anti-metastatic activity of bLf against other types of highly metastatic cancer cells. To this end, three highly metastatic cancer cell lines, reported to display V-ATPase at the plasma membrane, were used: PC-3, MG-63 and MDA-MB-231, prostate, osteosarcoma and breast cancer cell lines, respectively. Results showed that the susceptibility to bLf of PC-3 and MG- 63 cancer cell lines was similar to that of the breast cancer MDA-MB-231 regarding both inhibition of cell proliferation and induction of intracellular acidification. Moreover, we found that V-ATPase expression seemingly increased in the three cell lines in comparison to a non-tumorigenic cell line. These data encouraged us to implement several biochemical and analytical approaches, including flow cytometry, western blot, immunofluorescence and confocal microscopy in order to dissect the possible interplay between V-ATPase and bLf in these cell lines. Overall, the results herein obtained may be further explored to develop new cancer therapy strategies against highly metastatic cancers.

Atualmente, o cancro é uma das doenças mais letais no mundo e as metástases constituem a principal causa de mortalidade associada ao cancro, o que reforça a importância do desenvolvimento de terapias mais direcionadas e eficazes. Neste sentido, a lactoferrina (Lf) tem surgido como um agente seguro e eficaz na terapia do cancro. A Lf é uma proteína natural com afinidade para o ferro, derivada do leite, que está presente em muitos tecidos e fluídos biológicos. Curiosamente, foi descoberto que a Lf exibe atividade anticancerígena e anti-metastática contra uma vasta gama de linhas celulares cancerígenas. Contudo, ainda não se conhecem os alvos celulares da Lf que estão implicados no seu mecanismo de ação, o que limita o uso desta proteína na terapia do cancro. Assim, a descoberta dos alvos subjacente à atividade anticancerígena da Lf é de extrema importância e será explorada no presente trabalho. Recentemente, resultados do nosso grupo demonstraram que a Lf de origem bovina (bLf) é preferencialmente citotóxica para linhas de cancro da mama altamente metastáticas através da inibição da bomba de protões V-ATPase, não tendo qualquer efeito em células não tumorigénicas. No presente estudo, o nosso objetivo é entender se este mecanismo de ação poderá explicar a atividade anticancerígena e anti-metastática da bLf contra outros tipos de células de cancro também altamente metastáticas. Desta forma, para todos os ensaios foram utilizadas três linhas celulares de cancro altamente metastáticas, descritas como tendo V-ATPase na membrana plasmática, nomeadamente: PC- 3, MG-63 e MDA-MB-231, linhas celulares de cancro de próstata, osteossarcoma e cancro da mama, respetivamente. Os resultados demonstraram que, à semelhança do que acontece na linha celular de cancro de mama, as linhas celulares PC-3 e MG-63 são também sensíveis à bLf, quer a nível da inibição da proliferação celular quer da indução de acidificação intracelular. Além disso, nas três linhas foi observado um aumento na expressão da V-ATPase em comparação com uma linha não tumorigénica. Estes dados impulsionaram a utilização de várias técnicas bioquímicas e analíticas, incluindo citometria de fluxo, western blot e microscopia de fluorescência e confocal, com o objetivo de entender a relação entre a V-ATPase e a bLf nestas linhas celulares. Em suma, os resultados aqui obtidos poderão ser explorados para o desenvolvimento de novas estratégias de terapia para cancros altamente metastáticos.