Desenvolvimento e validação do método LNA-FISH para deteção de Aeromonas

Abstract

Um potencial problema em aquacultura são as infeções bacterianas que são facilmente transmissíveis podendo contaminar uma grande variedade de espécies de peixes, levando a grandes perdas económicas. O género Aeromonas compreende um grande número de espécies patogénicas para peixes, e representa uma das principais causas de perdas na aquacultura. Torna-se necessário a melhoria de métodos para o diagnóstico e controlo deste patógeneo de forma a minimizar o seu impacto. A utilização de técnicas moleculares tem sido mencionada como alternativa viável para detetar e diagnosticar surtos de doenças, prevenindo perdas económicas em aquacultura. O método de hibridação fluorescente in situ (FISH) tem sido muito explorado na área da microbiologia alimentar. É um método de deteção simples, rápido e altamente sensível que utiliza sondas marcadas por fluorescência cujo alvo são regiões específicas de ácido ribonucleico (RNA) bacteriano. Este método tem sofrido um desenvolvimento notável devido à aplicação de moléculas sintéticas na construção das sondas, que tornam o FISH mais rápido, robusto e sensível. Neste trabalho o principal objetivo foi o desenvolvimento e otimização de uma sonda para deteção de Aeromonas spp com recurso a uma molécula sintética, o LNA (locked nucleic acid). Uma completa otimização não foi conseguida, pois apesar dos vários parâmetros testados e da elevada afinidade da sonda, não foi possível eliminar completamente a hibridação cruzada com espécies não -Aeromonas. Foi possível verificar que a eficiência da sonda depende de uma relação muito forte entre o tipo/concentração de desnaturante e a concentração salina usada na solução de hibridação. Para melhor compreender este efeito a assim passar de uma otimização baseada numa abordagem tentativa-erro, para uma abordagem baseada em modelos da cinética de hibridação, usou-se a “response surface methodology” (RSM). RSM é uma ferramenta matemática e estatística que permite modelar e analisar problemas influenciados por inúmeras variáveis de forma a encontrar uma aproximação razoável do relacionamento real entre esse conjunto de variáveis. Foi possível perceber que, dos três desnaturantes testados, a Ureia foi a que permitiu obter um maior sinal de hibridação, previsto a ocorrer a uma temperatura de hibridação de 50ºC para 5M de NaCl numa concentração de Ureia de 4M.

A potential problem in aquaculture are bacterial infections that can easily be transmitted and may contaminate a wide variety of fish species, leading to major economic losses. The genus Aeromonas comprises a large number of species pathogenic to fish, which can cause infections worldwide and is a major cause of losses in aquaculture. It is necessary to improve methods for rapid diagnosis and control of this pathogen in order to minimize its impact. The use of molecular techniques has been mentioned as a viable alternative to detect and diagnose disease outbreaks, preventing economic losses in aquaculture. The fluorescent in situ hybridization (FISH) method has long been explored in the field of food microbiology. It is a simple detection method that uses fast and highly sensitive fluorescence probes that target specific regions of bacterial ribonucleic acid (RNA). This method has been suffering a remarkable development due to the application of synthetic molecules in the construction of probes, which make FISH faster, more robust and sensitive. In this work, the main objective was the development and optimization of a probe for detection of Aeromonas spp using a synthetic molecule, LNA (locked nucleic acid). Despite the probe high affinity; a complete optimization was not achieved because cross-hybridization with non-Aeromonas species was not completely eliminated. It was possible to verify that probe efficiency is strongly dependent on a relationship between the type and concentration of denaturant and the salt concentration used in the hybridization solution. To better understand this effect and move from a trial-and–error optimization to an approach based on hybridization kinetics models, the "response surface methodology" (RSM) was used. RSM is a mathematical and statistical tool that allows to model and analyze behavious influenced by many variables in order to find a reasonable approximation of the actual relationship between this set of variables. It can be seen that, from the three denaturants tested, the urea was the one that allowed the best hybridization signal, predicted to occur at an hybridization temperature of 50 ° C for NaCl at a concentration of 5M and Urea at 4M.