Engineering of fatty acid production and secretion in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Production of renewable liquid biofuels, that can substitute fossil fuels, has emerged as a major challenge for Biotechnology. Biodiesel, a more ecological alternative to petroleum based fuels, is currently obtained by the transesterification of vegetable oils with methanol or ethanol to produce fatty acid methyl esters (FAMEs) or ethyl esters (FAEEs), respectively. However, biodiesel production from plant oils requires intensive use of farmland, water, pesticides and fertilizers, and is restricted by geographical and seasonal issues that render the process economically, environmentally and ethically problematic. Biodiesel, produced by oleaginous microorganisms, could be an attractive alternative, since the utilization of diesel fuel is more efficient than, for example, ethanol. Oleaginous algae and yeast may accumulate very high (up to 80%) levels of intracellular lipids but two drawbacks are the relatively complicated extraction process and the subsequent transesterification with the accompanying glycerol by-product formation. The purpose of this work was to apply metabolic engineering of fatty acid synthesis and secretion, in the model yeast S. cerevisiae, in order to create a microorganism able to produce and secrete free fatty acids. S. cerevisiae is a suitable model, since lipid metabolism has been studied extensively and all genes encoding enzymes directly involved in lipid synthesis are known. In S. cerevisiae, activation of exogenous long-chain fatty acids to coenzyme A derivatives, prior to metabolic utilization, is mediated by the fatty acyl-CoA synthetases Faa1p and Faa4p. It has been shown previously that free fatty acids are secreted from a faa1faa4 double mutant. In this work, the “delitto perfetto” method was applied to delete these two fatty acyl-CoA synthetases generating genetically clean strains without markers or bacterial DNA. Results show that this technique can be used to generate multiple knockouts by recycling the marker gene. This modification was combined with engineering the pyruvate dehydrogenase bypass in order to enhance the supply of acetyl-CoA and NADPH to the fatty acid biosynthesis pathway. A strain where FAA1 and FAA4 were deleted and acetyl-CoA synthetase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase were overexpressed secreted 2145mol.L-1 fatty acids to the extracellular media. In S. cerevisiae the acyl-CoA oxidase Pox1p, encoded by POX1, catalyses the first metabolic step of fatty acid -oxidation, and null mutants are unable to grow on fatty acids as sole carbon source. ScPox1p is the ortholog of the human acyl-CoA oxidase 1, and its expression is strongly induced by fatty acids. A triple knock-out mutant faa1/4  pox1  studied in this work secreted 2141mol.L-1 fatty acids to the extracellular media. Fatty acids form insoluble particles in cell culture media of the cells and these can be found as a white precipitate after centrifugation. In this work it was found that these particles scatter light in a way that can be measured with a spectrophotometer. The application of this property, as a method for rapid semiquantitative measurement of extracellular fatty acid concentration, shows a good correlation between the spectrophotometric and chromatographic analysis of the supernatants. The fatty acid production of the modified strains was analysed by optical density of the extracellular medium and gas chromatography. Strains constructed in this work have a 1.6 fold increased fatty acid secretion phenotype when compared with the faa1/4  mutant. However, secreted fatty acids disappear late in the growth phase, presumably metabolized by the cells. In summary, in this work it was possible to quantify and characterize fatty acids secreted to the extracellular medium by mutant Saccharomyces cerevisiae strains and the concentrations achieved are so far the highest reported in the literature.

A produção de combustíveis líquidos renováveis, que possam substituir os combustíveis fósseis, tem emergido como um desafio à Biotecnologia. O biodiesel, uma alternativa mais ecológica aos combustíveis derivados do petróleo, é actualmente obtido pela transesterificação de óleos de origem vegetal com metanol ou etanol para produzir metil-ésteres ou etil-ésteres de ácidos gordos respectivamente. Contudo, a produção de biodiesel a partir de óleos de plantas requer o uso intensivo de áreas agrícolas, água, pesticidas e fertilizantes, e está limitada por questões geográficas e sazonais que tornam o processo económica, ambiental e eticamente problemático. O biodiesel, produzido por microrganismos oleaginosos, pode ser uma alternativa atractiva uma vez que a sua utilização é mais eficiente que, por exemplo, o etanol. Algas e leveduras oleaginosas podem acumular altos níveis (até 80%) de lípidos intracelulares mas as duas desvantagens inerentes à sua utilização são o relativamente complicado processo de extracção e subsequente transesterificação, com a formação de glicerol como subproduto. O objectivo deste trabalho foi, através da engenharia metabólica da síntese e excreção de ácidos gordos, na levedura modelo S. cerevisiae, criar um microorganismo capaz de produzir e excretar ácidos gordos para o meio extracelular. S. cerevisiae é um modelo apropriado uma vez que o seu metabolismo de lípidos é extensivamente conhecido e todos os genes que codificam enzimas directamente envolvidas na síntese lipídica são conhecidos. Em S. cerevisiae, a activação dos ácidos gordos de cadeia longa a derivados da coenzima A, antes da sua utilização, é mediada pelas acil-CoA sintetases Faa1p e Faa4p. Foi já demonstrado que estirpes em que ambos FAA1 e FAA4 foram eliminados excretam ácidos gordos. Neste trabalho o método “delitto perfetto” foi aplicado na eliminação destes dois genes, originando uma estirpe de S. cerevisiae geneticamente limpa, sem marcadores nem DNA heterólogo. Os resultados mostram que este método pode ser aplicado para a construção de mutantes múltiplos pela reciclagem do gene marcador. Esta modificação foi conciliada com alterações na via de “bypass” da piruvato desidrogenase, de forma a aumentar a quantidade de NADPH e acetil-CoA fornecidos à via de síntese de ácidos gordos. Numa estirpe onde ambas as acil-CoA sintetases Faa1p e Faa4p foram eliminadas, e onde foram sobre expressas a acetil- CoA sintetase, a glusose-6-fosfato desidrogenase e a acetaldeído desidrogenase, foram excretados 2145 mol.L-1 de ácidos gordos para o meio extracelular. Em S. cerevisiae a acil-CoA oxidase Pox1p, codificada pelo gene POX1, catalisa o primeiro passo da -oxidação de ácidos gordos, e mutantes em que este gene foi eliminado são incapazes de crescer num meio com ácidos gordos como única finte de carbono. A Pox1p é ortóloga da acil-CoA oxidase 1 de humanos e a sua expressão é fortemente induzida pela presença de ácidos gordos. Um mutante de eliminação triplo em que se eliminou este gene, além de FAA1 e FAA4, excretou 2141 mol.L-1 de ácidos gordos para o meio extracelular. Os ácidos gordos formam, no meio extracelular, partículas insolúveis que podem ser observadas como um precipitado branco após a centrifugação da cultura. Neste trabalho observou-se que estas partículas dispersam luz duma forma que pode ser quantificada por um espectrofotómetro. A aplicação desta propriedade, como um método semi-quantitativo para a medição da concentração extracelular de ácidos gordos, mostrou uma boa correlação entre as análises espectrofotométricas e cromatográficas dos sobrenadantes. A produção de ácidos gordos nas estirpes modificadas foi analisada por medições da densidade óptica do meio extracelular e por cromatografia gasosa. As estirpes construídas neste trabalho aumentaram 1,6 vezes a excreção de ácidos gordos relativamente ao mutante faa1/4Contudo, os ácidos gordos excretados desaparecem do meio extracelular durante a fase estacionária do crescimento presumivelmente sendo metabolizados pelas células. Em resumo, neste trabalho foi possível quantificar e caracterizar ácidos gordos, excretados para o meio extracelular, por estirpes mutantes de Saccharomyces cerevisiae e as concentrações alcançadas são as mais altas até agora reportadas na literatura.