Produção de proteínas recombinantes através de um novo sistema de fusão em Escherichia coli

Abstract

As proteínas desempenham um papel fundamental nos sistemas biológicos de todos os seres vivos, exercendo inúmeras funções que permitem o crescimento e desenvolvimento dos indivíduos. O desenvolvimento da biotecnologia nas últimas décadas expandiu o interesse da indústria para a produção de proteínas em áreas tão diversas como a farmacêutica, no diagnóstico e tratamento de doenças genéticas, a agricultura ou o ambiente. Numa indústria, cada vez mais rentável, procuram-se novos métodos que permitam maiores eficiências através da optimização de processos e redução de custos. Por outro lado, a produção e purificação de proteínas biologicamente activas, na sua conformação correcta e no estado solúvel são objectivos essenciais para uma produção eficaz que vise a implementação comercial destes compostos. Estudos anteriores demonstraram a capacidade da proteína Fh8 (8 kDa), uma proteína segregada pelo parasita Fasciola hepatica nas fases iniciais da infecção, como tag de expressão e de solubilidade em Escherichia coli. Assim se formou o novo sistema de fusão utilizado neste estudo (Hitag® - tag Fh8) que, pela conjugação do seu pequeno peso molecular com a capacidade de aumentar a expressão e melhorar a solubilidade proteica, se torna numa óptima opção para a produção de proteínas recombinantes se comparado com os outros fusion tags existentes actualmente. A proteína estudada neste sistema foi a hidrolase do molinato (MolA) que é codificada por um gene existente na bactéria Gulosibacter molinativorax ON4T. Este organismo pertence a um conjunto de cinco membros capazes de mineralizar o molinato, um herbicida sistémico que é amplamente aplicado nos campos de arroz para a eliminação de ervas daninhas e que provoca a contaminação dos aquíferos em todo o mundo. O presente trabalho teve por objectivo a produção da proteína recombinante MolA em E. coli, através do uso do tag de fusão Fh8, a avaliação e optimização das suas propriedades a nível da expressão e da solubilidade, bem como a sua purificação. No estudo aqui apresentado, foi possível clonar e expressar a proteína recombinante (Fh8MolA) com sucesso. A optimização das condições de expressão permitiu concluir que, de modo a reduzir custos de operação e obter melhores níveis de expressão e de solubilidade, a proteína deve ser induzida overnight à temperatura de 18°C, no momento em que a densidade óptica (OD600) da cultura se situe entre os 0,6 a 0,8 e com uma concentração de IPTG de 0,5mM. A mini-purificação realizada por cromatografia de afinidade por IMAC permitiu constatar que se conseguiu recuperar a proteína recombinante com maior grau de pureza.

Proteins play a fundamental role in biological systems of all living beings, exercising many functions that allow the growth and development of individuals. The development of biotechnology in last decades expanded the interest of industry for the production of proteins in such diverse areas as pharmaceuticals, diagnosis and treatment of genetic diseases, agriculture or the environment. In an industry, increasingly profitable, it seeks new methods allowing greater efficiency through process optimization and costs reduction. On the other hand, the production and purification of biologically active proteins, in their correct conformation and soluble state, are essential objectives for an efficient production aimed at commercial implementation of these compounds. Previous studies showed the ability of Fh8 protein (8 kDa), a protein secreted by Fasciola hepatica parasite in the early stages of infection, such as expression and solubility fusion tag in Escherichia coli. Therefore, the new fusion system used in this study (Hitag ® - Fh8 tag) was formed. The combination of their small molecular weight with the ability to increase expression and improve the protein solubility became it a great choice for production of recombinant proteins compared with other currently available fusion tags. The protein studied in this system was molinate hydrolase (MolA) which is encoded by a gene of the bacteria Gulosibacter molinativorax ON4T. This organism belongs to a five-membered mixed culture able to mineralize molinato, a systemic herbicide which is widely used in rice fields for the elimination of weeds and which causes contamination of aquifers throughout the world. The present work aimed the production of recombinant protein MolA in E. coli, through the use of Fh8 fusion tag, the evaluation and optimization of its expression and solubility properties, as well as its purification. In the study presented here, it was possible to clone and express the recombinant protein (Fh8MolA) successfully. The optimization of the expression conditions allowed to concluded that, in order to reduce operation costs and to obtain better expression and solubility yields, protein should be induced overnight at 18 °C when the culture optical density (OD600) is in a range of 0,6 to 0,8 and with a concentration of 0,5 mM IPTG. The mini-purification processed through affinity chromatography by IMAC pointed that was able to recover the protein with a greater state of purity.