Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/34720

TítuloFabry disease : novel insights into secondary lipid alterations and invariant Natural Killer T cell deficiency
Outro(s) título(s)Doença de Fabry : novas revelações sobre as alterações lipídicas secundárias e deficiência das células “invariant Natural Killer T”
Autor(es)Quinta, Rui Jorge Azevedo Lamela da
Orientador(es)Miranda, Maria Clara Pereira de Sá
Reis, R. M.
Data23-Jun-2014
Resumo(s)Fabry disease is an X-linked lysosomal storage disease (LSD) that results from deficient activity of the lysosomal hydrolase α-Galactosidase A (α-Gal A) and progressive storage of glycosphingolipids (GSLs), mainly globotriaosylceramide (Gb3), in cells and body fluids with consequent multiorgan dysfunction. Enzyme replacement therapy (ERT) is the only available causal treatment for Fabry patients. Although ERT can promote Gb3 clearance in some cell types, recent studies suggest that the clinical responses to ERT are not as robust as previously anticipated. In addition to the primary storage of Gb3, which is directly caused by the underlying enzymatic defect, evidence indicated the existence of alterations in other lipids in the urine of Fabry patients, including different lipid species of ceramide (Cer), lactosylceramide (LacCer), glucosylceramide (GlucCer) and sphingomyelin (SM), that cannot be directly attributed to deficient α-Gal A activity and have been referred to as “secondary” lipid alterations. Even though a direct link between these alterations and Fabry disease pathogenesis has not yet been established, secondary lipid abnormalities have been described in other LSDs and growing evidence indicates that they can be involved in the pathogenesis of these diseases. However, studies that analyze secondary lipid alterations in Fabry disease are still scarce. Such studies are crucial for increasing the knowledge on the pathophysiology of Fabry disease and mechanisms of regulation of sphingolipid levels. In this thesis, data was obtained contributing to a further elucidation of secondary alterations of sphingolipid metabolism in this disease. More specifically, two groups of bioactive sphingolipid molecules were analyzed: GlucCers and Cers. It was revealed that in a mouse model of Fabry disease (α-Gal A-/0, Fabry knockout mice), a decrease in the total amount of GlucCer is present, without alterations in the total level of Cer. Further analysis indicated that different lipid species of GlucCer are unequally reduced in different tissues of these mice. Subsequently, the ability of ERT to correct the reduced GlucCer levels was investigated. Consistently with a differential uptake of the administered recombinant α-Gal A by different cell types, we demonstrated that ERT can successfully normalize hepatic GlucCer levels but has no effect on splenic, renal and cardiac GlucCer. Intriguingly, an analysis of GlucCer and Cer in the plasma of hemizygote patients revealed normal levels of GlucCer and Cer but an increased GlucCer/Cer ratio. This imbalance showed a positive correlation with the Fabry disease biomarker globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3). These results indicate that α-Gal A deficiency is accompanied by complex alterations of sphingolipid metabolism and that ERT can partially correct a secondary decrease in GlucCer that is present in Fabry knockout mice. The intralysosomal accumulation of GSLs has also been shown to have an impact on the immune system. In fact, GSLs are antigens for lipid-specific T cells, including invariant Natural Killer T (iNKT) cells. These cells are numerically decreased in several mouse models of LSDs, including Fabry disease, but the molecular basis for this is still controversial. In order to gain a better understanding of iNKT cell defects in α-Gal A deficient mice, the effects of ageing and ERT on iNKT cells of these mice were evaluated. It was shown that peripheral iNKT cell deficiency aggravates with age in these animals, in parallel with the progressive storage of Gb3. Moreover, it was demonstrated that iNKT cell subsets are unequally affected in the spleen of older mice, showing a diminished iNKT CD4+/CD4- cell ratio due to a greater loss in splenic CD4+ iNKT cells. Subsequent analyses revealed that ERT is able to stabilize splenic iNKT cell percentage through a specific influence on splenic CD4+ iNKT cells, without any effect on thymic and hepatic iNKT cells. These data suggest that ERT has a positive organ and subset-specific effect on iNKT cells of Fabry knockout mice. In addition to iNKT cells, evidence suggested that other T lymphocyte populations might be affected by the lysosomal dysfunction that is present in Fabry knockout mice. However, analyses of T lymphocytes of these animals that excluded the specific influence of the iNKT cell phenotype on the global T lymphocyte population were still nonexistent prior to the work presented in this thesis. Preliminary results indicate that Fabry knockout mice present imbalances in peripheral, non-iNKT, T lymphocytes that are unresponsive to ERT. In summary, the results presented in the scope of this thesis contributed to a further elucidation of secondary lipid alterations and immune system abnormalities in Fabry disease. Even though the ERT experiments presented throughout this thesis were restricted to the Fabry disease mouse model, the finding that ERT only corrects some of the alterations described in this work also reinforces the present notion that ERT for Fabry disease is of limited effectiveness.
A doença de Fabry é uma doença lisossomal de sobrecarga (LSD) ligada ao cromossoma X causada pela deficiente atividade da hidrolase lisossomal α-Galactosidase A (α-Gal A) e pela acumulação progressiva de glicoesfingolípidos (GSLs), principalmente globotriaosilceramida (Gb3), nas células e fluidos corporais com consequente disfunção multiorgânica. A terapia de substituição enzimática (ERT) é o único tratamento causal disponível para estes doentes. Embora a ERT consiga reduzir os depósitos de Gb3 em alguns tipos celulares, estudos recentes sugerem que a eficácia da ERT é limitada. Para além da acumulação primária de Gb3, que é diretamente causada pelo defeito enzimático subjacente, evidências prévias sugerem a existência de alterações noutros lípidos na urina dos doentes de Fabry, incluindo diferentes espécies lipídicas de ceramida (Cer), lactosilceramida (LacCer), glucosilceramida (GlucCer) e esfingomielina (SM), que não podem ser diretamente atribuídas à atividade deficiente de α-Gal A, sendo assim designadas de alterações lipídicas “secundárias”. Apesar de não ter sido ainda estabelecida uma associação direta entre estas alterações e a patogénese da doença de Fabry, já foram descritas alterações lipídicas secundárias noutras LSDs e há indícios crescentes de que possam estar envolvidas na patogénese destas doenças. Contudo, são escassos os estudos relativos a esta temática na doença de Fabry. Tais estudos revestem-se de grande importância ao permitir aprofundar o conhecimento da patofisiologia desta doença e dos mecanismos de regulação dos níveis de esfingolípidos na célula. Nesta tese, foram obtidos dados que contribuíram para a compreensão das alterações secundárias do metabolismo dos esfingolípidos nesta patologia. Mais especificamente, foram analisados dois grupos de esfingolípidos bioactivos: as GlucCers e Cers. Verificou-se que o modelo murino da doença de Fabry (α-Gal A-/0, ratinho Fabry) apresenta um decréscimo nos níveis totais de GlucCer, sem alterações nos níveis totais de Cer. Análises adicionais demonstraram que diferentes espécies lipídicas de GlucCer estão reduzidas de uma forma desigual em diferentes tecidos destes animais. Subsequentemente, foi investigada a capacidade da ERT em corrigir os baixos níveis de GlucCer. De uma forma consistente com uma absorção diferencial da enzima α- Gal A recombinante dependente do tipo celular, foi demonstrado que a ERT consegue normalizar com sucesso os níveis de GlucCer hepáticos mas não tem efeito nos níveis de GlucCer esplénicos, cardíacos e renais. Curiosamente, uma análise de GlucCer e Cer no plasma de doentes hemizigóticos revelou níveis de GlucCer e Cer normais mas um aumento na razão GlucCer/Cer. Demonstrou-se que este desequilíbrio apresenta uma correlação positiva com o biomarcador da doença de Fabry globotriaosilesfingosina (lyso-Gb3). Estes resultados indicam que a deficiência em α-Gal A é acompanhada de alterações complexas no metabolismo de esfingolípidos e que a ERT consegue corrigir parcialmente o decréscimo secundário em GlucCer presente nos ratinhos Fabry. A acumulação intracelular de GSLs também tem impacto ao nível do sistema imune. De facto, os GSLs são antigénios para células T lípido específicas, incluindo as células T “invariant Natural Killer” (iNKT). Estas células estão diminuídas em diversos modelos animais de LSDs, incluindo o ratinho Fabry, mas a base molecular para estas alterações é ainda controversa. Na tentativa de aprofundar o conhecimento sobre os defeitos das células iNKT nos ratinhos deficientes em α-Gal A, foram avaliados os efeitos do envelhecimento e da ERT nas células iNKT destes animais. Demonstrou-se que a deficiência periférica nas células iNKT agrava com a idade, em paralelo com a acumulação de Gb3. Por outro lado, foi demonstrado que diferentes subpopulações de iNKT são desigualmente afectadas no baço de ratinhos mais velhos, com uma razão iNKT CD4+/CD4- diminuída causada por uma maior perda nas células iNKT CD4+ esplénicas. Análises posteriores mostraram que a ERT consegue estabilizar a percentagem de células iNKT no baço, através de uma influência específica nas células iNKT CD4+ deste órgão, sem efeito nas células iNKT do timo ou do fígado. Estes resultados indicam que a ERT tem um efeito positivo nas células iNKT do ratinho Fabry, de um modo dependente do órgão e subpopulação de iNKT. Para além das células iNKT, outros estudos sugeriam que outras populações de linfócitos T pudessem também ser afectadas pela disfunção lisossomal presente no ratinho Fabry. Contudo, ainda não tinha sido efectuada uma análise da população de linfócitos T nestes animais que excluísse a influência específica do decréscimo das células iNKT na população global de linfócitos. Resultados preliminares apresentados no contexto desta tese sugerem que o ratinho Fabry possui alterações em linfócitos T periféricos, não iNKT, que não respondem à ERT. Em resumo, os resultados aqui apresentados permitiram o aprofundamento do conhecimento sobre as alterações lipídicas secundárias e anomalias no sistema imune na doença de Fabry. Apesar das experiências de ERT efetuadas serem restritas a um modelo animal, a observação de que esta terapia só corrige algumas das alterações descritas nesta tese reforça a ideia atual de que a ERT na doença de Fabry é de eficácia limitada.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de doutoramento em Ciências da Saúde
URIhttps://hdl.handle.net/1822/34720
AcessoAcesso restrito UMinho
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
ICVS - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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