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TítuloAnalysis of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms
Outro(s) título(s)Análise da variabilidade da expressão genética em biofilmes de S. epidermidis
Autor(es)Sousa, Cármen
Orientador(es)Cerca, Nuno
Johansson, Björn
Data2014
Resumo(s)S. epidermidis is the most frequently bacteria isolated from human epithelia, and for a long time, it has been regarded as an innocuous commensal bacterium. However, currently, this bacteria persist as a major cause of hospital and community-acquired infections. It is primarily associated with infections of indwelling medical devices, by the formation of a structure called a biofilm. The biofilms can quickly adapt to new conditions and consequently, can result in the appearance of infections, that are resistance to many antibiotics and mechanisms of the host immune defense. So, it is crucial to study gene expression and their influence in biofilm formation. In gene expression studies, there are three fundamental experimental steps which have some variability: RNA extraction, reverse-transcriptase reaction and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). However, since biofilms are very heterogeneous communities, often gene expression studies reveal a high variability. The objective of this work was to demonstrate and understand the influence in the variability of gene expression quantification, by the individual experimental steps required for gene expression quantification, namely bacterial growth, RNA extraction, reverse transcriptase and real-time quantitative PCR. We tested the biofilm formation and the presence of key genes in several strains of S. epidermidis in order to select the strains to be used in the gene expression studies. Our results demonstrated that biologic variability was the step which more influence gene expression quantification. Additionally, we proposed an optimized protocol to enhance gene expression reproducibility in S. epidermidis biofilms and our results were favorable since we reduced the biologic variability with a pool of 20 biofilms, as determined by the quantification of gene expression in two independent strains.
Staphylococcus epidermidis é um agente bacteriano comensal que coloniza, maioritariamente, o epitélio humano mas, mediante determinadas condições, pode tornar-se num agente patogénico oportunista. Atualmente, esta espécie é causadora da maior parte de infeções adquiridas em ambiente hospitalar, especificamente em dispositivos médicos. Os mecanismos de colonização e adaptação desta bactéria não estão totalmente estudados, no entanto é conhecido que esta bactéria torna-se patogénica quando o hospedeiro está imunodeprimido e o processo infecioso ocorre devido à inserção do dispositivo médico e, consequentemente, à formação de agregados tridimensionais denominados de biofilme. Os biofilmes fornecem inúmeras vantagens às bactérias nomeadamente, adaptação a novos ambientes, proteção física, resistência a antibióticos e mecanismos de defesa ao sistema imunitário do hospedeiro. Todas estas interações resultam de diferentes perfis de expressão genética e, desta forma, é extremamente importante o estudo das alterações na expressão dos genes, quando os biofilmes estão presentes. Para tal, são fundamentais três etapas experimentais: extração de RNA, síntese de cDNA e PCR quantitativo em tempo real. No entanto, sabe-se que há variabilidade inerente a cada uma das etapas, bem como relativo ao crescimento das estruturas heterogéneas dos próprios biofilmes. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a influência das várias etapas experimentais na variabilidade na expressão genética no crescimento bacteriano. Ao longo deste trabalho, estudou-se a capacidade de formação de biofilme e a presença dos genes de interesse, entre diferentes estirpes de S. epidermidis. De seguida, selecionou-se as estirpes mais indicadas para a quantificação da expressão genética. Os nossos resultados demonstraram que a variabilidade biológica foi o principal causador da variabilidade na quantificação da expressão dos genes. Por conseguinte, propusemos a otimização de um simples protocolo experimental, de modo a minimizar esta variabilidade. Esta otimização baseou-se, na utilização de uma mistura de 20 biofilmes independentes, utilizados num único passo de extração de RNA. Foi observado, com sucesso, a redução da variabilidade biológica, utilizando duas estirpes independentes de S. epidermidis.
TipomasterThesis
DescriçãoDissertação de mestrado em Molecular Genetics
URIhttp://hdl.handle.net/1822/30272
AcessoopenAccess
Aparece nas coleções:BUM - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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