Methods for detection of proteins, nucleic acids and biomolecular complexes adapted for flow cytometry

Abstract

O in situ Proximity Ligation Assay (PLA) é um método que permite a detecção selectiva e sensível de proteínas, ácidos nucleicos e complexos biomoleculares em células e em tecidos. O método é baseado na ligação de sondas de afinidade (anticorpos secundários conjugados com sequências de DNA) a anticorpos primários. Quando próximas, estas sondas formam um circulo que é amplificado e detectado através da hibridização de oligonucleótidos marcados fluorescentemente. Deste modo, este método fornece sinais localizáveis e quantificáveis ao nível de células individuais, o que consiste uma característica importante no diagnóstico de doenças heterogéneas. Assim, o presente trabalho teve por objectivo aumentar a capacidade multiplexed do in situ PLA, com vista a aplicação em citometria de fluxo. Diversos conjuntos de oligonucleótidos (denominados Sistemas) foram desenvolvidos e testados usando um modelo do cancro da mama. A eficiência desses Sistemas foi analisada individualmente através da quantificação do receptor do factor de crescimento epidermal humano 2 (HER-2), bem como a reactividade cruzada entre os Sistemas. Usando uma anticorpo contra a actina e contra o HER-2, os dois Sistemas caracterizados por possuir uma maior eficiência e menor reactividade cruzada foram aplicados num ensaio para detecção simultânea destes antigénios. Por fim, procedeu-se à avaliação do anticorpo anti-HER-2 fosfoTirosina (pTyr) 1248 através da análise da expressão de homo- e heterodímeros de HER-2 em células tratadas e não tratadas com EGF. Os resultados indicam que os reagentes desenvolvidos possibilitam a visualização e quantificação de moléculas individuais ao microscópio. Além disso, a ligase T4 foi demonstrada como sendo imprópria para um método multiplexed, ao contrário das ligases Ampligase e Tth. Por último, o local de fosforilação Tyr1248 foi avaliado como não sendo activado pela exposição a EGF. Ao desenvolver novas tecnologias que permitam a detecção simultânea de diversos biomarcadores, este trabalho espera contribuir para o desenvolvimento de novas terapias em diversas áreas.

The in situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a method that enables the selective and sensible detection of proteins, nucleic acids and biomolecular complexes in cells and tissues. It is based on the binding of affinity probes (secondary antibodies conjugated to DNA sequenses) to primary antibodies. When in close proximity, these probes form a circle that is amplified and detected by hybridization of fluorescently labeled oligonucleotides. Hence, this method provides localized, quantifiable signals at a single-cell level, which is an important feature when diagnosing heterogeneous diseases. Based on this, the present study aimed to increase the multiplexed capacity of in situ PLA, for future application in flow cytometry. Sets of oligonucleotides (named Systems) were developed and tested using a breast cancer mode. The efficiency of those Systems was analysed separately by quantification of the human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2), as well as the cross-reactivity between the Systems. Using an anti-actin and an anti-HER-2 antibody, the two Systems characterized by a high efficiency and low cross-reactivity were used in a PLA for the simultaneous detection of both antigens. Lastly, the evaluation of an anti-HER-2 phosphoTyrosine (pTyr) 1248 antibody was performed by addressing the expression of HER-2 homo- and heterodimers in cells treated and untreated with EGF. The results indicate that the developed PLA reagents provide the ability to visualize and quantify single molecules by microscopy. Moreover, the T4 DNA ligase was found to be unsuitable for a multiplexed assay, contrarily to the Ampligase DNA ligase and the Tth DNA ligase. Lastly, the Tyr1248 phosphorylation site was found not to be activated after cells exposure to EGF. By developing new state-of-the-art technologies that allow the simultaneous detection of several biomarkers, this work aims at contributing to the development of novel therapies in different fields.