Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/1822/21483

TítuloFused polycyclic and coumarin derivatives as fluorescent phototriggers for neurotransmitter caging
Autor(es)Fernandes, Maria José G.
Orientador(es)Costa, Susana P. G.
Gonçalves, M. Sameiro T.
Data14-Set-2012
Resumo(s)Photochemical release is an important strategy in the study of various processes in areas such as chemistry, biology, medicine and materials science since it allows the controlled release of molecules with biological, analytical and biomedical relevance. The use of photocleavable protecting groups in the control of the spatial and temporal evolution of species with biological activity has become relevant in the investigation of the mechanisms of signal transduction at the cellular level or in the photocontrolled drug release. The strategy involves the covalent linking of a photocleavable group (caging group) to a bioactive molecule, rendering it inactive, and then this "encapsulated" conjugate (caged compound) is introduced into the biological system of interest, either an in vitro culture or in vivo. The release (uncaging) and intracellular distribution of the bioactive molecule is controlled in time and space by irradiation with a light pulse. The main goal of this thesis consisted in the design, synthesis and characterisation of new (hetero)aromatic fluorescent compounds and their study as photocleavable protecting groups/phototriggers for bioactive molecules as well as temporary fluorescent markers. Novel fluorescent compounds were synthesized bearing suitable functionalization to be used in the coupling to amino and carboxylic acid groups of neurotransmitter molecules. As fluorophores, polycyclic aromatic compounds, such as naphthalene and pyrene, and oxygen heterocycles such as coumarins and benzocoumarins were used. The method used for the synthesis of coumarins and benzocoumarins was the Pechmann reaction between appropriate phenol derivatives and β-ketoesters. Having in mind the study of the application of these compounds as photocleavable protecting groups, the synthesis of fluorescent conjugates with bioactive molecules, such as the neurotransmitter amino acids β-alanine, γ-aminobutyric acid (GABA), glutamic acid, tyrosine and 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), and biogenic amines derived from tryptophan (serotonin and tryptamine) and tyrosine (dopamine, norepinephrine, tyramine and octopamine), was performed by coupling through a covalent bond at the amino (carbamate bond) and carboxylic acid (ester bond) terminals. The behaviour of these conjugates was evaluated under different photolysis conditions, namely the wavelength of irradiation and the solvent systems (mixtures of organic solvents and aqueous buffer solutions) in a photochemical reactor equipped with lamps of 254, 300 and 350 nm. Given the nature of the bioactive molecules under study and considering the prospective photorelease of this type of compounds in biological media, it is desirable that the photocleavage occurs in short irradiation times at such a wavelength that is compatible with the media to minimize potential side effects. As a result, cleavage with lamps of 419 nm was tested for those conjugates that had short irradiation times at 350 nm. A cleavage kinetic study was undertaken, by monitoring the irradiated reaction mixture by high performance liquid chromatography (HPLC) with UV spectrophotometry detection. In some cases the monitoring was also done by 1H NMR spectroscopy. Given that the photorelease of bioactive molecules using a two-photon technique allows a greater spatial and temporal control, with less damage to cells and deeper penetration of the light beam in the tissue, a one- and two-photon excitation time-resolved fluorescence study was performed and a two-photon photolysis with the amino acid neurotransmitters β-alanine, tyrosine and glutamic acid - benzocoumarin conjugates was carried out. The characterization of all new synthesised compounds was made by the usual spectroscopic techniques (UV/Vis absorption, FT-IR and 1H and 13C NMR) and analytical techniques (mass spectrometry). Considering the fluorescence properties of the obtained compounds, the fluorescence emission parameters (wavelength of maximum emission, relative fluorescence quantum yield and Stokes shift) were also determined.
A libertação fotoquímica é uma estratégia importante no estudo de processos variados em áreas tais como a química, biologia, medicina e ciências dos materiais uma vez que permite a libertação controlada de moléculas com relevância biológica, analítica e biomédica. A utilização de grupos protetores fotocliváveis no controlo da evolução espacial e temporal de espécies com atividade biológica tornou-se relevante na investigação dos mecanismos de transdução de sinais a nível celular ou na libertação fotocontrolada de fármacos. A estratégia utilizada consiste em ligar de forma covalente um grupo fotoclivável (caging group) a uma molécula bioativa, tornando-a inativa, e de seguida este conjugado “encapsulado” (caged compound) é introduzido no meio biológico de interesse, seja uma cultura in vitro ou in vivo. A libertação (uncaging) e distribuição intracelular da molécula bioativa é controlada no tempo e espaço através da irradiação com um pulso de luz. O objetivo principal desta dissertação consistiu no design, síntese e caracterização de novos compostos fluorescentes (hetero)aromáticos e o seu estudo como grupos protetores fotocliváveis/phototriggers para moléculas bioativas, bem como marcadores fluorescentes temporários. Foram obtidos novos compostos fluorescentes com funcionalização adequada para serem usados no acoplamento com grupos amino e ácido carboxílico de moléculas neurotransmissoras. Como fluoróforos foram usados compostos aromáticos policíclicos como o naftaleno e o pireno, e heterociclos de oxigénio como as cumarinas e benzocumarinas. O método utilizado na síntese de cumarinas e benzocumarinas foi a reação de Pechmann, entre derivados fenólicos e β-cetoésteres adequados. Com vista a estudar a aplicação destes compostos como grupos protetores fotocliváveis, efetuou-se a síntese de conjugados fluorescentes de várias moléculas bioativas tais como os aminoácidos neurotransmissores β-alanina, ácido γ-aminobutírico (GABA), ácido glutâmico, tirosina e 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA), e aminas biogénicas derivadas do triptofano (serotonina e triptamina) e da tirosina (dopamina, norepinefrina, tiramina e octopamina) por acoplamento através de uma ligação covalente quer no terminal amino (ligação do tipo carbamato) quer no terminal carboxilo (ligação do tipo éster). Foi avaliado o comportamento destes conjugados face a diferentes condições de fotólise, nomeadamente o comprimento de onda de irradiação e sistemas de solvente (mistura de solventes orgânicos e soluções tampão aquosas), num reator fotoquímico equipado com lâmpadas de comprimento de onda de 254, 300 e 350 nm. Dada a natureza das moléculas bioativas em estudo e de forma a considerar possíveis aplicações de fotolibertação em meio biológico, é desejável que a fotoclivagem ocorra com tempos de irradiação curtos a um comprimento de onda que seja compatível com o meio para minimizar potenciais efeitos indesejáveis. Dessa forma, testou-se a clivagem ao comprimento de onda de 419 nm, para os conjugados com tempos de irradiação curtos na irradiação a 350 nm. Foi realizado o estudo cinético da fotoclivagem por monitorização da mistura reacional irradiada por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) com deteção espetrofotométrica na zona do UV. Em alguns casos, foi também realizada a monitorização através de espetroscopia de RMN de 1H. Dado que a fotolibertação de moléculas bioativas utilizando a técnica de dois fotões permite um maior controlo espacial e temporal, com menor dano nas células e uma penetração mais profunda do feixe de luz nos tecidos, foi efetuado o estudo de fluorescência resolvida no tempo com excitação por um ou dois fotões e a fotólise com dois fotões nos conjugados de benzocumarina com os aminoácidos neurotransmissores β-alanina, tirosina e ácido glutâmico. Foi feita a caraterização de todos os compostos novos sintetizados, pelas técnicas espetroscópicas usuais (absorção no UV/Vis, IV e RMN de 1H e 13C) e por técnicas analíticas (espetrometria de massa). Dadas as propriedades de fluorescência dos compostos obtidos, foram também determinados os parâmetros de emissão de fluorescência (comprimentos de onda de emissão máxima, rendimento quântico relativo de fluorescência e desvio de Stokes).
TipodoctoralThesis
DescriçãoTese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Química)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/21483
AcessorestrictedAccess
Aparece nas coleções:CDQuim - Teses de Doutoramento
BUM - Teses de Doutoramento

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