Development of fermentation process for fungal fucoidanases production

Abstract

This thesis is focused in the development of an integral bioprocess for fungal fucoidanases production, in order to develop new strategies of fermentative conditions and parameters. In the recent years, the interest in the research field of fucoidans and fucoidanases has strongly increased due to the high potential in medical exploitation of fucoidans and its degradation products. Fucoidans are highly sulfated polysaccharides of brown algae widely used in fields as food and beverage, pharmacy, health medicine and cosmetics, due to their important biological properties as antitumoral, anticoagulant and antiviral activities. Enzymes with known specificities that catalyze the degradation of fucoidan are important tool for studying the relation between structure and biological role of this class of polysaccharide. Firstly, Aspergillus niger PSH, Mucor sp. 3P, and Penicillium purpurogenum GH2 were selected among several fungal strains, isolated from Northeast Mexican desert, for their fucoidan hydrolyzing ability, by measuring the strains kinetic and morphometric behavior over plate assays containing fucoidan as target polysaccharide and testing different nitrogen sources. Furthermore, submerged fermentations testing the synergy of fucoidan with others sugars for inducing high enzyme titles showed that A. niger PSH synthesized the highest titles of sulfated fucan-degrading enzymes with the culture media of fucoidan-sucrose. Secondly, Fucus vesiculosus algae were collected at Praia Norte, Viana de Castelo, Portugal, for hydrothermal extraction of sulfated polysaccharides (fucoidan) using microwave and autohydrolysis processes. Experimental designs were applied evaluating different conditions of temperature/ pressure, time and alga/water ratio to establish a condition to maximize the extraction results. For microwave assisted extraction at 120 psi, 1 min and 1:25 alga:water rate was the best condition for the fucoidan recovery (18%); whereas the extraction by autohydrolysis showed optimal yield at 180 °C for 20 min (16.5% w/w). The obtained products were characterized and it was verified the presence of fucose as the main constituent of these polysaccharides and a SO3 content higher than 20%. Moreover, as fucoidan is said to possess so many interesting bioactivities, the extracted products were analyzed for antioxidant activity, displaying a strong free radical scavenging effect; this behavior is possibly associated with the high content of sulphate groups. Finally, the solid stated fermentation (SSF) system was assessed for the induction of fucoidanases using the selected fungal strains and the Fucus vesiculosus algae, obtained after both hydrothermal extraction. A rotational drum bioreactor was designed to carry out the culture experiments. The results showed that the maximum fucoidanase activity was obtained with Mucor sp. 3P and algae after autohydrolysis pre-treatment production (3.82 U L-1); also the mixture of the solids showed to influence in the induction of the enzyme production. Moreover, a SSF scale up experiments showed that controlling the moisture content and the addition of inert support on algae substrates increment the enzyme production (9.62 U L-1). These results indicate, that the fucoidan hydrolytic enzyme can be extracellular, induced by a solid substrate rich of fucose and fucoidan. In general, with the established and developed methods of this thesis was possible to determine the solid state fermentation parameters for fucoidan hydrolytic enzyme production using terrestrial fungal strains and also allowed to set up the extraction conditions and physicochemical characteristics for the production of sulfated fucans by environmental friendly process. This opens up new vistas to modify fucoidan and to develop the postulated bioactive potentials.

Esta tese foca-se no desenvolvimento de um bioprocesso integral para a produção de fucoidanases fúngicas, a fim de desenvolver novas estratégias de condições fermentativas e parâmetros. Nos últimos anos, o interesse na área de pesquisa de fucoidanos e fucoidanases aumentou significativamente devido ao elevado potencial na exploração médica de fucoidanos e dos seus produtos de degradação. Os fucoidanos são polissacarídeos de algas castanhas, altamente sulfatados, bastante usados em áreas como a dos alimentos e bebidas, farmacêutica, médica e cosmética, devido às suas importantes propriedades biológicas como as suas actividades antitumoral, anticoagulante e antiviral. Enzimas com especificidades conhecidas que catalisam a degradação de fucoidano são uma ferramenta importante para o estudo da relação entre a estrutura e papel biológico desta classe de polissacarídeos. Numa primeira fase, Aspergillus niger PSH, Mucor sp. 3P e Penicillium purpurogenum GH2 foram seleccionadas entre várias estirpes de fungos isoladas do deserto do Nordeste do México, devido à sua capacidade de hidrolisar fucoidano, através da medição do comportamento cinético e morfométrico das estirpes em placas de ensaio contendo fucoidano como polissacarídeo alvo e testando diferentes fontes de azoto. Além disso, as fermentações submersas testando a sinergia de fucoidano com outros açúcares para indução de elevadas actividades enzimáticas evidenciaram que A. niger PSH sintetizou a mais elevada actividade de enzimas que degradam fucanos sulfatados com o meio de cultura de fucoidano-sucrose. Numa segunda fase, algas Fucus vesiculosus foram recolhidas na Praia Norte, Viana do Castelo, Portugal, para extracção hidrotermal dos polissacarídeos sulfatados (fucoidanos) usando processos de microondas e auto-hidrólise. Foram aplicados desenhos experimentais para avaliar diferentes condições de temperatura/pressão, tempo e razão alga/água para estabelecer uma condição para maximizar os resultados de extracção. Na extracção assistida por microondas, 120 psi, 1 min e uma razão de 1:25 água:água, foram as melhores condições para a recuperação de fucoidano (18%); enquanto que a extracção por auto-hidrólise revelou um rendimento óptimo a 180 ºC durante 20 minutos (16.5% w/w). Os produtos obtidos foram caracterizados e verificouse a presença de fucose como o principal constituinte desses polissacarídeos e um conteúdo em SO3 superior a 20%. Além disso, como se diz que o fucoidano possui tantas bioactividades interessantes, os produtos extraídos foram analisados a nível de actividade antioxidante, exibindo um forte efeito na eliminação de radicais livres; este comportamento está possivelmente associado ao elevado conteúdo em grupos sulfato. Finalmente, o sistema de fermentação em estado sólido (FES) foi avaliado para a indução de fucoidanases utilizando as estirpes fúngicas seleccionadas e as algas Fucus vesiculosus, obtidas após extracção hidrotermal. Foi desenhado um bioreactor de tambor rotativo para realizar os ensaios de cultura. Os resultados demonstraram que a actividade máxima de fucoidano foi obtida com Mucor sp. 3P e com algas após produção com pré-tratamento de auto-hidrólise (3.82 U L-1); a mistura dos sólidos também demonstrou a influência na indução da produção da enzima. Além disso, as experiências de aumento de escala de FES mostraram que, controlando o teor de humidade, a adição do suporte inerte em substratos de algas aumenta a produção de enzima (9.62 U L-1). Estes resultados indicam que a enzima que hidrolisa o fucoidano pode ser extracelular, induzida por um substrato sólido rico em fucose e fucoidano. De um modo geral, com os métodos estabelecidos e desenvolvidos nesta tese foi possível determinar os parâmetros de fermentação em estado sólido para produção de enzimas que hidrolisam o fucoidano usando estirpes de fungos terrestres e também foi possível estabelecer as condições de extracção e as características físico-químicas para a produção de fucanos sulfatados por um processo amigo do ambiente. Isto abre novas vistas para modificar o fucoidano e desenvolver os potenciais bioactivos postulados.