Insights into pathology and neurodegeneration features in a transgenic mouse model of Machado-Joseph disease

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar Ataxia 3 (SCA3), is the most common autosomal dominant ataxia worldwide, and is caused by a CAG repeat expansion within the coding region of the ATXN3 gene. The clinical variability of the disease phenotype as well as the age of onset depend on the length of the expanded repeat. The anticipation phenomenon is most frequently associated with repeat expansions in paternal transmission. MJD patients with a repeat expansion above 44 CAGs in the ATXN3 gene present cytoplasmic and/or intranuclear ataxin-3 aggregates and neuronal cell loss in specific areas of the brain. However, some questions remains unanswered in this disease: why only some subpopulations of neurons are affected, although ataxin- 3 is everywhere; what underlies this selective neuronal vulnerability; are these neurons dysfunctional or dying? In an attempt to address these issues, we took advantage of studying a cDNA transgenic mouse model (CMVMJD) expressing the mutant human ataxin-3 under the regulation of the CMV promoter (pCMV), previously generated in our lab. This transgenic mouse model shows an important overlap with genetic and clinical features of MJD, namely genetic instability of the expanded CAG repeat and a motor impairment phenotype. In this work, we performed an extensive pathological analysis of MJD mouse brains, that revealed a significant atrophy in the thalamus and in the dentate neurons. Increased GFAP immunostaining with reactive astrocytes was observed in the vestibular nuclei and substantia nigra of transgenic mice. Regarding cell death, we have searched for evidence of different cell death types (apoptosis and necrosis) by TUNEL assay, caspase-3 analysis and Fluoro-Jade B staining. We did not find any differences between wild-type and MJD transgenic mice, suggesting that probably the affected neurons are not dying, at least by apoptosis or necrosis, instead, they might just be dysfunctional. We also analysed of the somatic mosaicism in neuronal and non-neuronal tissues through aging revealed a significant increase in the mosaicism index of specific brain regions such as the pons, substantia nigra, cerebellar cortex, hipocampus, striatum, deep cerebellar nuclei and hypothalamus with age. However, there was no correlation between the extent of the mosaicism and the pathological involvement of a given region. The results allow us to conclude that the pCMVMJD94 mouse is a good model to study the pathogenic mechanisms of MJD, mimicking an early stage of the disease.

A doença de Machado-Joseph, também conhecida por Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), é a ataxia autossómica dominante mais comum em todo o mundo, causada por uma repetição de CAGs na região codificante do gene ATXN3. A variabilidade no fenótipo da doença assim como a idade de surgimento dos sintomas depende no tamanho da repetição expandida. O fenómeno de antecipação está mais frequentemente associado a transmissões paternas. Pacientes com DMJ com expansões acima de 44 CAGs revelam agregados citoplasmáticos e /ou nucleares e perda neuronal em áreas do cérebro específicas. Algumas questões chave permanecem por esclarecer. Por exemplo, nesta doença apenas algumas subpopulações de neurónios são afectadas, embora a ataxina-3 seja expressa em todas as áreas. O que está por detrás desta vulnerabilidade neuronal selectiva? Estarão estes neurónios a morrer ou estarão disfuncionais? Numa tentativa de responder a estas perguntas, utilizámos um modelo em ratinho que expressa o cDNA da ataxina-3 humana mutada, sob a regulação do promotor CMV (pCMV), previamente gerado no nosso laboratório. Neste trabalho, fizemos uma extensa análise patológica de cérebros de ratinho DMJ que revelaram uma atrofia relevante no tálamo e núcleos denteados. Também se observou um aumento da proteína GFAP, revelando um aumento da reactividade dos astrócitos, nos núcleos vestibular e substantia nigra dos ratinhos transgénicos. Também fizemos um rastreio de diferentes tipos de morte celular (apoptose e necrose) por TUNEL, análise da activação da caspase-3 (imunohistoquímica e western-blot) e coloração com Fluoro-Jade B. Não encontrámos diferenças significativas entre ratinhos do tipo selvagem e transgénicos, sugerindo que provavelmente estes neurónios não estarão a morrer, pelo menos por apoptose ou necrose, estando possivelmente disfuncionais. Para além disso, a repetição de CAG expandida, variou em mais de 50% das transmissões nos ratinhos transgénicos, com expansões típica transmitidas em meioses paternas e contracções em maternas. A análise do mosaicismo somático em tecidos neuronais e periféricos, durante o envelhecimento, revelou um aumento no índex de mosaicismo em regiões específicas do cérebro e mostrou ser dependente da idade. Este ratinho transgénico apresenta características genéticas e clínicas importantes que se sobrepõem às da DMJ, nomeadamente instabilidade intergeracional da expansão de CAGs, características patológicas da doença (astrogliose e neurónios atrofiados, nas regiões relevantes) e um fenótipo de descoordenação motora. Estes resultados permitiram-nos concluir que o ratinho pCMVMJD94 é um bom modelo para estudar os mecanismos patogénicos da DMJ, mimetizando estadios precoces da doença.