New applications of particulate materials in tissue engineering strategies : delivery of bioactive agents and selective cell isolation

Abstract

During the past few years, researchers working in tissue engineering (TE) have realized that drug delivery is a fundamental part of the TE strategy. Therefore, a large number of technologies have been optimized to guide the potential of drug delivery in those applications. Drug delivery systems (DDS) can be designed to provide controlled release of bioactive molecules to the site of action with minimal side-effects by reducing the exposure of the drug to other tissues. Microparticulate DDS are claimed to have several advantages, such as enhanced bioavailability, possibility for targeting delivery and minimally invasive administration, together with greater efficacy/safety. This PhD work describes attempts to develop particulate systems with potential application in TE strategies. Microparticles based on natural origin polymers (starch and chitosan and blends thereof) were used. In addition, a synthetic polymer (poly-e-caprolactone, PCL) was used alone or combined with starch. For the preparation of these particulate systems, emulsion procedures, based on evaporation of solvents or use of crosslinking agents, were optimized. The developed systems were characterized in terms of morphology, physicochemical properties, particle size and size distribution. Their potential as DDS either for antibiotics (gentamicin sulphate, GTM), steroids (Dexamethasone, DEX) or growth factors (bone morphogenetic protein 2, BMP-2) was evaluated with encapsulation efficiencies of 93% for DEX, 67% for GTM and 24% for BMP-2. The release profiles were evaluated in environments mimicking physiological conditions and were characterized by three main phases typical of drug release from biodegradable carriers: i) burst release, ii) period of minimal release, and iii) the release of the remaining active agent while the polymeric matrix is degraded. The in vitro biocompatibility of the developed system was investigated using different cell lines where aspects such as cytotoxicity, cell proliferation and morphology were evaluated. Moreover, the maintenance of the activity/function of all entrapped molecules was investigated. The antibacterial activity of released GTM was assessed by an in vitro disc diffusion susceptibility test using Gram positive bacteria (Staphylococcus aureus) whereas the bioactivity of DEX and BMP-2 was analyzed by determining their ability to induce osteogenic differentiation of precursor cells. For the tested conditions, all developed microparticles were non-cytotoxic, highly biodegradable and suitable as carriers for sustained delivery purposes. The ability to isolate living cells is an essential aspect of TE research. Magnetic cell separation methods are among the most efficient methods for cell separation. Therefore, an additional objective of this work was to develop magnetic functionalized particles for cell isolation (e.g. stem cell subpopulations). Towards this goal, surface functionalized magnetic poly-e- caprolactone microparticles (m-PCL) were fabricated. 13% of magnetite nanoparticles (core) were effectively entrapped within a poly-e-caprolactone (shell). Amino and epoxy groups were introduced on the surface of the m-PCL. The m-PCL were characterized for morphology, particle size and size distribution, physicochemical and magnetic properties. Their effectiveness for covalent coupling of protein-like molecules was evaluated by using bovine serum albumin, resulting in coupling efficiency higher than 47% for epoxy and 71% for amino functionalized m-PCL. Additionally, cell viability, proliferation and morphology upon contact with developed microparticles were evaluated. The m-PCL were shown to be non-cytotoxic and their surface functionalization did not show any detrimental influence on cell viability and proliferation. Overall, the developed microparticulate systems are versatile and very promising to be used in TE strategies.

Durante os últimos anos, tem havido um crescente interesse no desenvolvimento de sistemas de libertação controlada para aplicação em estratégias de engenharia de tecidos (ET) humanos. Os sistemas de libertação controlada podem ser utilizados com a finalidade de melhorar o índice terapêutico de fármacos por alteração da sua distribuição e, consequentemente, aumentar a sua eficácia terapêutica e/ou reduzir a sua toxicidade. Diversas tecnologias têm sido desenvolvidas e optimizadas a fim de direccionar o potencial da libertação controlada em aplicações de ET. Sistemas na forma de micropartículas para libertação de agentes bioactivos apresentam diversas vantagens tais como controlo da sua biodisponibilidade, possiblidade de direccionar a terapia e administração não invasiva. O presente trabalho de doutoramento pretende avaliar e explorar a potencial de sistemas de micropartículas para libertação controlada de agentes bioactivos em estratégias de ET de osso. Para tal, foram desenvolvidas micropartículas à base de polímeros naturais, nomeadamente misturas de amido e quitosano. Foi também usado o polímero sintético policaprolactona (PCL) isolado ou combinado com amido. As partículas foram produzidas recorrendo a técnicas de emulsão utilizando diferentes agentes reticuladores ou por evaporação de solventes. As propiedades físico-químicas assim como a morfologia e o tamanho das partículas foram avaliados de forma a caracterizar os sistemas desenvolvidos. Como agentes bioactivos foram usados o antibiótico gentamicina (GTM), o corticóide dexametasona (DEX) e o factor de crescimento proteína morfogenética do osso (BMP-2), tendo estes sido incorporados nos sistemas desenvolvidos com eficiências de encapsulamento de 67%, 93% e 24%, respectivamente. Os perfis de libertação foram estudados de forma a mimetizar condições fisiológicas, tendo-se observado três fases distintas: i) uma fase inicial em que ocorre libertação súbita do agente incorporado, ii) período de libertação mínima e iii) libertação do agente activo remanescente que ocorre com a degradação da matriz polimérica. A biocompatibilidade dos sistemas desenvolvidos foi testada in vitro usando linhas celulares, sendo avaliados parâmetros como a citotoxicidade, morfologia e proliferação celular. A actividade dos agentes incorporados foi analisada por diferentes métodos. A actividade antibacteriana da gentamicina libertada foi avaliadada pelo método da difusão em agar, que se baseia na determinação dos halos de inibição do crescimento de um dado microorganismo (bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus). A actividade osteogénica dos agentes encapsulados DEX e BMP-2 foi analisada através de estudos in vitro com células precursoras, tendo-se avaliado a sua morfologia, proliferação e viabilidade, bem como a expressão de marcadores da linhagem osteogénica (e.g. ALP, osteocalcina). Todas as partículas desenvolvidas mostraram ser biodegradáveis e não citotóxicas nas condições testadas. Além disso, apresentam uma libertação controlada do agente incorporado sem comprometer a sua acção, o que as torna adequadas para aplicações em estratégias de ET. É conhecido que algumas nanopartículas magnéticas apresentam um enorme potencial para diversas aplicações biotecnológicas, nomeadadamente no isolamento de subpopulações de células estaminais/precursoras. Estas partículas podem ser revestidas com um material biocompatível e funcionalizadas com anticorpos específicos para determinado tipo de células. De facto, este trabalho envolveu também o desenvolvimento de partículas magnéticas funcionalizadas para o isolamento de células. Nanopartículas de magnetite foram revestidas com uma solução polimérica de PCL de forma a obter partículas do tipo core-shell. As partículas foram caracterizadas em termos de morfologia, tamanho e distribuição, sendo também avaliadas as suas propriedades fisico-quimicas e magnéticas. Posteriormente foram funcionalizadas com grupos epóxi e amino para ligação de proteínas na superfície. A sua biocompatabilidade foi avaliada em estudos in vitro. As micropartículas magnéticas não apresentaram citoxicidade nem afectaram a viabilidade e proliferação celulares, podendo ser usadas para isolamento de células. Em geral, pode afirmar-se que os sistemas de micropartículas desenvolvidas neste trabalho são versáteis e apresentam grande potencial para serem aplicadas em estratégias de engenharia de tecidos.