Baker’s yeasts for use in frozen-dough technology : sugar utilization in freeze tolerant Torulaspora delbrueckii strains and elucidation of cryo-resistance mechanisms

Abstract

Bread is a central dietary item in most countries of the world. Currently, frozen dough technology is extensively used in the baking industry to supply oven-fresh bakery products to consumers and to improve labor conditions for bakers. Since freeze–thaw stress affects the viability and activity of yeast cells, one serious disadvantage of this technology is a significant reduction in leavening activity during frozen storage. To develop improved baker’s yeasts for use in frozen-doughs, yeast strains with high freeze tolerance as well as mechanisms of the freeze–thaw stress response in yeast cells, have been investigated with great interest. Torulaspora delbrueckii strains PYCC 5321 and PYCC 5323, isolated from traditional corn and rye bread are of potential industrial interest since they display high resistance to osmotic and Na+ injury and an exceptional freeze/ thaw tolerance, making them suitable for frozen dough technology. However, few reports exist on the genetics, biochemistry and physiology of T. delbrueckii in contrast to the vast knowledge on the traditional baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae, constituting a draw back for their commercial application. Variability among T. delbruecckii strains PYCC 5321 and PYCC 5323 has been neither fully investigated nor reported by molecular typing. Therefore, we performed the molecular characterization of these yeast strains by both mitochondrial DNA restriction pattern analysis (RFLP's) and electrophoretic karyotyping, and showed that strain delimitation within the species T. delbrueckii by these methods is possible. In addition, we propose the use of RFLP's of mitochondrial DNA as an accessible molecular method to routinely discriminate T. delbrueckii strains. For a better evaluation of the potential offered by this yeast to the baking industry we have also characterized sugar utilization patterns, and respiration/fermentation rates. Our results show that T. delbruecki behaves very similarly to S. cerevisiae with respect to sugar utilization and regulation patterns. However, when compared to a baker’s yeast strain of S. cerevisiae, T. delbrueckii showed a higher contribution of respiration during aerobic fermentation of glucose, sucrose and maltose. This was evidenced by biomass yields determined in YP medium with either glucose, sucrose or maltose, which showed a very significant increase when high aeration rates were used (from 20% increase, in glucose or sucrose medium, to 80%, in maltose medium). This trait represents an advantage for the large-scale production of baker’s yeast. As shown for S. cerevisiae, we also have shown that sugar transport is the rate limiting step of sugar utilization in rich media in T. delbrueckii. In Chapter 4 we have cloned and functionally characterized a new transporter gene from T. delbrueckii, IGT1, which encodes an intermediate-affinity glucose transporter. IGT1, is located upstream of LGT1, the first hexose transporter described in T. delbrueckii, and displays a high homology to this gene and to other yeast glucose transporter genes. Functional characterization of Igt1p in a S. cerevisiae hxt-null strain revealed that it encodes a transporter able to mediate the uptake of glucose, fructose and mannose. Furthermore, similarly to S. cerevisiae Hxt2p, apparent Km of Igt1 transporter can be modulated by medium glucose concentration. Cells of S. cerevisiae hxt-null strain transformed with IGT1, when grown in 0.1% glucose displayed biphasic uptake kinetics with an intermediate- (Km = 6.5 ± 2.0 mM) and a high-affinity (Km = 0.10 ± 0.01 mM) component. Evidences that point to the existence of several hexose transporters with different glucose affinities and regulation in T. delbrueckii are also presented. Additionally, we have also established an improved gene disruption method for T. delbrueckii, and using this method constructed a Δlgt1 strain. Analysis of this mutant revealed that LGT1 disruption leads to a significant, although not severe, decrease in glucose transport in comparison with the wild-type strain. Finally, special attention was given to yeast freeze resistance. The mechanisms of freeze tolerance and freeze sensitivity in yeast are still poorly understood and are an important issue to be solved for the development of bakers' yeast strains that are more suitable for the frozen-dough process. In a previous work it was shown that the higher freeze resistance of the T. delbrueckii strains under study, could be attributed to their higher capacity to preserve plasma membrane integrity. In S. cerevisiae a decrease in temperature induces the expression of many genes, some of which result in a cold-sensitivity phenotype when deleted. However, little is known about the role played by many cold-responsive genes, and the regulatory mechanisms that control their response. HSP12 gene is one of these genes. Furthermore, it was shown that Hsp12p could be localized at the plasma membrane making it a good candidate for a role in the preservation of membrane integrity during freezing. Chapter 6 focuses on the cold-shock responses of a Δhsp12 mutant, emphasizing the Hsp12p contribution to freeze tolerance and its relation with trehalose. We show that Hsp12p plays a role in cryoresistance, although the hsp12 null mutant revealed to be more resistant to freezing than the wild type strain. We found that stationary-phase cells of the Δhsp12 mutant have a higher intracellular trehalose concentration than wild type cells that could account for its higher resistance. However, heat-induced trehalose accumulation is impaired in this mutant. Overexpression of HSP12 in a Δtps1 strain (not able to accumulate trehalose) allowed to demonstrate a clear increase in resistance to freezing storage and also to heat stress. Exploitation of yeast activities in the bread-making industry requires fundamental knowledge of their ecology, physiology, biochemistry and molecular biology. This knowledge, to which this work aimed to contribute, provides the base for genetic improvement strategies, and the new molecular methods for yeast identification and characterization, open up the possibility for future innovation in bakers’ yeasts.

O pão constitui um alimento essencial para uma dieta saudável a nível mundial. Actualmente, a utilização de massas congeladas na indústria da panificação apresenta várias vantagens, como o fornecimento aos consumidores de produtos de padaria e pastelaria sempre frescos e a melhoria das condições de trabalho, contribuindo para a sua expansão e aceitação. Os danos provocados pelo congelamento/ descongelamento afectam a viabilidade e a actividade das células de levedura, conduzindo a uma redução significativa na sua capacidade de levedação das massas. Com o objectivo de desenvolver leveduras de panificação melhoradas para aplicação em massas panares congeladas, têm-se estudado e procurado estirpes de levedura com elevada crioresistência, assim como investigado mecanismos envolvidos na resposta ao stress provocado pelo congelamento/ descongelamento. As estirpes de Torulaspora delbrueckii PYCC 5321 e PYCC 5323, isoladas do pão tradicional de milho e de centeio, possuem grande interesse com potencial aplicação na indústria da panificação. De facto, estas estirpes apresentam elevada resistência ao stresse osmótico e ao Na+ e uma tolerância excepcional ao congelamento/ descongelamento, tornando-as apropriadas para o uso em massas panares congeladas. No entanto, existem poucos estudos de caracterização genética, bioquímica ou fisiológica da levedura T. delbrueckii, contrastando com o vasto conhecimento existente sobre a levedura tradicional de panificação Saccharomyces cerevisiae, o que constitui uma desvantagem para a aplicação comercial desta levedura não convencional. As estirpes T. delbruecckii PYCC 5321 e PYCC 5323 foram anteriormente caracterizadas por estudos fisiológicos e bioquímicos, no entanto a sua variabilidade molecular não tinha ainda sido investigada. Por outro lado, também não se encontrava descrito um método expedito de tipagem molecular para diferenciação à estirpe de isolados de T. delbruecckii. Por essa razão, realizámos uma caracterização das estirpes PYCC 5321 e PYCC 5323, por análise de restrição de DNA mitocondrial (RFLP) e de cariotipagem electroforética, demonstrando que é possível a sua distinção/ diferenciação através destes dois métodos. Adicionalmente, propomos o uso de RFLP do DNA mitocondrial como um método molecular para a discriminação de rotina de estirpes de T. delbrueckii. Para melhor avaliar o potencial biotecnológico desta levedura caracterizámos os seus padrões de utilização de açúcares e respectivas taxas de respiração/ fermentação. Os resultados mostraram que T. delbruecki se comporta de uma forma idêntica a S. cerevisiae, no que diz respeito aos padrões de utilização e regulação de açúcares. No entanto, quando comparada a uma estirpe de panificação de S. cerevisiae, T. delbrueckii mostrou uma maior contribuição da respiração durante a fermentação aeróbia da glucose, sacarose e maltose. Este aspecto foi evidenciado pelo aumento significativo dos rendimentos em biomassa, determinados em meio YP suplementado com os diferentes açúcares e usando taxas de arejamento elevadas. Esta característica representa uma clara vantagem para a produção em larga escala de levedura de panificação. De acordo com o descrito em diferentes trabalhos para S. cerevisiae, os estudos aqui descritos mostraram que em T. delbrueckii o transporte constitui o passo limitante no consumo de maltose e glucose. No Capítulo 4 descreve-se a clonagem e caracterização funcional de um novo gene transportador de T. delbrueckii, IGT1, que codifica um transportador com afinidade intermédia para a glucose. Este gene, localiza-se a montante e na mesma cadeia do gene LGT1, o primeiro transportador de hexoses descrito em T. delbrueckii. Ambos os genes possuem elevada homologia com outros genes transportadores de glucose em leveduras. A caracterização funcional da proteína Igt1p na estirpe mutante hxt de S. cerevisiae revelou que este gene codifica um transportador capaz de mediar o transporte de glucose, frutose e manose. Tal como se verificou para o transportador Hxt2p de S. cerevisiae, o Km do transportador Igt1 pode ser modulado pela concentração de glucose no meio de cultura. Células da estirpe mutante de S. cerevisiae, transformadas com o gene IGT1 e cultivadas em glucose 0,1%, mostraram uma cinética de transporte de glucose bifásica, constituída por uma componente de afinidade intermédia (Km = 6.5 ± 2.0 mM) e outra de alta afinidade (Km= 0.10 ± 0.01 mM). Os resultados apresentados sugerem ainda a existência de outros transportadores de hexoses com diferentes afinidades para a glucose em T. delbrueckii. Adicionalmente, foi desenvolvido um método melhorado de interrupção de genes em T. delbrueckii, com o qual foi possível obter a estirpe mutante Δlgt1. A interrupção do gene LGT1 resultou num decréscimo significativo embora não acentuado do transporte de glucose comparativamente com a estirpe selvagem. Por fim foi dada especial atenção à resistência ao congelamento em leveduras. Os mecanismos de tolerância e sensibilidade ao congelamento em leveduras constituem um assunto importante para o desenvolvimento de estirpes de panificação mais adequadas ao processo de congelamento de massas panares. Num trabalho anterior, foi demonstrado que a resistência ao congelamento das estirpes de T. delbrueckii aqui em estudo, poderia ser atribuída à sua maior capacidade de preservação da integridade da membrana. Em S. cerevisiae, uma diminuição da temperatura induz a expressão de vários genes, alguns dos quais originam um fenótipo de sensibilidade ao frio quando removidos. No entanto, pouco se sabe acerca do papel desempenhado por muitos destes genes e dos mecanismos reguladores que controlam esta resposta. O gene HSP12 é um desses genes. Além disso, a proteína Hsp12 parece estar localizada na membrana plasmática o que a torna uma boa candidata para um papel na preservação da integridade membranar durante o congelamento. O Capítulo 6 descreve as respostas ao frio do mutante Δhsp12, dando ênfase ao contributo da proteína Hsp12p na tolerância ao congelamento e à sua relação com a trealose. Os resultados demonstram que a proteína Hsp12 desempenha um papel na crioresistência apesar do mutante nulo no gene hsp12 se ter revelado mais resistente ao congelamento do que a estirpe selvagem. De facto, a estirpe mutante Δhsp12, apresentou uma concentração intracelular de trealose mais elevada quando comparada com a estirpe selvagem, o que parece justificar a sua maior crioresistência. A sobreexpressão do gene HSP12 na estirpe Δtps1 (que não tem capacidade de acumular trealose) revelou um claro aumento na tolerância ao congelamento bem como na resposta ao stress induzido pelo aumento da temperatura. Apesar do mutante Δhsp12 apresentar uma maior acumulação de trealose em fase estacionária, esta acumulação encontra-se diminuída em resposta ao choque térmico, parecendo indicar que a proteína Hsp12 tem também um papel na resistência a temperaturas elevadas. A utilização de leveduras na indústria de panificação requer um conhecimento aprofundado da sua ecologia, fisiologia, bioquímica e biologia molecular. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretendeu contribuir para este conhecimento e para o fornecimento de novas estratégias de biologia molecular para a identificação e caracterização destas leveduras, abrindo novas possibilidades para a inovação em leveduras de panificação.