Cellular aproaches and tailor-made 3D starch-based scaffolds for improved vascularization in bone tissue engineering strategies

Abstract

The establishment of a vascular supply in bone grafts is presently identified as the main pitfall in bone tissue engineering and the major hurdle for the clinical application of the engineered constructs. Granted the importance of intraosseous vasculature in bone physiological processes, the existence of a microcirculation is not only essential to assure cell survival in strategies that involve cell seeding but also on all the other approaches aimed at bone tissue formation. This is particularly critical in the regeneration of large bone defects because in these cases diffusion can not assure the metabolic demands of the cells and post-implantation vascularization is a slow and insufficient process to assure the success of the implant. The recognition of the aforementioned problem urged the development of strategies to induce and accelerate the formation of a blood vessel network to simultaneously supply the implant and functionally connect to the host vasculature. The research work described in this thesis addresses strategies to augment vascularization on different formulations of starch poly(I-caprolactone) (SPCL) fiber-mesh scaffold, a biodegradable material previously proposed for bone regeneration. Endothelial cells (ECs) are the key element in angiogenesis. Vascularization strategies either directly or indirectly target this cell type. Thus, the first part of this thesis aimed to build a body of evidence regarding the compatibility of ECs and SPCL fiber-mesh scaffolds and the effect of surface and architectural modifications on ECs’ biology. In chapter III, ECs derived from the macro- and microvasculature are shown to adhere and proliferate on SPCL fiber-mesh scaffolds. Furthermore, seeded cells not only expressed the most typical endothelial marker von Willebrand factor (vWF) but also maintained cell-cell contact through the expression of Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molecule 1 (PECAM-1). ECs are also known to participate in inflammatory response and regarding this role, cells on scaffolding material were sensitive to a pro-inflammatory stimulus, as shown by the induction of the expression of the cell adhesion molecules. Despite the fact that these results indicate a good interaction between cell and substrate, the adhesion of ECs to the scaffold material was dependent on a pre-coating with fibronectin. Chapter IV consisted in the development of strategies for the surface modification of SPCL fibermesh scaffold in order to promote the adhesion of ECs independently of protein coating of the scaffold. Argon (Ar) plasma revealed itself to be a very effective methodology for the proposed task. Hence, plasma modified scaffolds could successfully sustain ECs’ growth, proliferation, maintenance of endothelial monolayer integrity and the expression of endothelial markers. This improved overall biological outcome was the reflex of the novel surface properties and their interaction with adsorbed adhesive proteins that ultimately modulated cell behaviour. The next two chapters V and VI focused on the innovative designs of SPCL fiber-mesh scaffolds inspired in the extracellular matrix (ECM). This was achieved by means of combining in the same 3D structure a nano-network with a micro-fiber mesh. It was hypothesized that the nano-network on nano/micro fiber-combined scaffold might favour the 3D guidance and distribution of ECs and might thus accelerate vascularization of the implanted constructs. In chapter V it was observed that addition of nano-fibers to the structure improved the spatial distribution of ECs in the bulk structure of the scaffold. This finding, together with the formation of microcapillary-like structures in an angiogenic environment, provided evidence of the ability of these structures to provide the structural and organizational stability necessary for ECs migration. Chapter VI described the development and characterization of collagen-nano and SPCL-micro fiber-combined scaffold, a structure similar to the one described in the previous chapter but with a built-in nano-network made of type I collagen. This combined structure incorporating the major structural protein of bone matrix was developed by a two-step methodology consisting in wetspinning followed by type I collagen electrospinning. The structural merit of this scaffolding material was evaluated by monocultures of osteoblast-like cells (SaOs-2) and human umbilical vein ECs (HUVECs). In the case of SaOs-2 it was observed increased proliferation and a different rearrangement of cell cytoskeleton on the nano-fibers, whereas HUVECs exhibited a peculiar organization in circular structures resembling the shape of microcapillary-like structures. The last chapter (chapter VII) presents the outcome of a complex cellular strategy consisting in the simultaneous culture of primary human osteoblasts (hOBs) with ECs derived from the microvasculature (HDMECs). It was successfully demonstrated that co-culturing hOBs with HDMEC on SPCL fiber-mesh scaffold resulted in the formation of microcapillary-like structures. The existence of branching, lumen and type IV collagen positive-staining in the perivascular region attested the complexity of the formed vascular structures. The mechanisms that supported and orchestrated this system comprised the dense matrix of type I collagen deposited by hOBs that provided the physical and chemical cues for migrating HDMECs; and the HDMEC:hOBs communication though the soluble factor vascular endothelial growth factor (VEGF) and by direct contact through the expression of the gap junction protein connexin43. In summary, the results reported in this thesis provide insights that can be used in the successful establishment of a vascular network in 3D starch-based scaffolding materials aimed at bone regeneration.

Actualmente é reconhecido que o principal obstáculo em engenharia de tecidos ósseos e à aplicação clínica dos seus produtos é o suprimento vascular dos implantes ósseos. Dada a importância da vasculatura intraóssea nos processos fisiológicos do osso, a existência de uma microcirculação é não só essencial para garantir a sobrevivência das células em estratégias que envolvam o seu cultivo, como em qualquer outra que vise a formação deste tipo de tecido. Esta questão é principalmente importante na regeneração de grandes defeitos ósseos, uma vez que nestes casos a difusão não consegue assegurar as necessidades metabólicas das células e a vascularização pós-implantação é um processo lento e insuficiente para garantir a viabilidade do implante. O reconhecimento deste problema levou ao desenvolvimento de estratégias para induzir e acelerar a formação de uma rede de vasos sanguíneos, que simultaneamente abasteça o implante e que garanta a ligação funcional à vasculatura do paciente. O trabalho descrito nesta tese reporta a estratégias para aumentar a vascularização em diferentes formulações de um suporte à base de fibras de amido/policaprolactona (SPCL), um material biodegradável previamente proposto para regeneração óssea. As células endoteliais são o elemento chave no processo de angiogénese. As estratégias de vascularização têm directa ou indirectamente este tipo celular como alvo. Assim, a primeira parte desta tese teve como objectivo reunir um conjunto de elementos relativos à compatibilidade das células endoteliais com o suporte de SPCL e o efeito das modificações superficiais e arquitectónicas na biologia destas mesmas células. No capítulo III prova-se que as células endoteliais originadas da micro- e macrovasculaturas aderem e proliferam nos suportes de SPCL. Para além desta evidência as células não só expressaram o marcador endotelial mais típico (factor von Willebrand, vWF), como também expressaram a molécula de adesão PECAM-1, sinónimo de coesão celular. As células endoteliais também são conhecidas pela sua participação na resposta inflamatória, e relativamente a esta função as células no suporte tridimensional revelaram-se sensíveis a um estímulo pró-inflamatório, como observado pela indução da expressão das moléculas de adesão celular. Apesar destes resultados indicarem uma interacção células-substrato favorável, a adesão das células endoteliais ao material polimérico estava dependente de um pré-revestimento com fibronectina. O capítulo IV consistiu na modificação superficial do suporte de SPCL com o intuito de promover a adesão das células endoteliais independentemente do revestimento proteico. O plasma de árgon (Ar) provou ser uma metodologia eficaz para evitar esta dependência. Assim sendo, os suportes 3D modificados por plasma puderam suportar eficientemente o crescimento celular das células endoteliais, proliferação, a manutenção da integridade da monocamada endotelial e a expressão dos respectivos marcadores. Este resultado foi o reflexo das novas propriedades de superfície e da sua interacção com as proteínas adesivas adsorvidas, que, por sua vez modulam o comportamento celular. Os dois capítulos seguintes incidiram nos designs inovadores dos suportes de SPCL, inspirados na matrix extracelular (ECM). Estes resultaram da combinação na mesma estrutura 3D de uma rede-nano com uma malha de micro-fibras. Foi sugerido que esta rede-nano poderia favorecer a orientação 3D e a distribuição das células endoteliais e desta forma acelerar a vascularização do implante. No capítulo V, observou-se que a adição das nano-fibras à estrutura 3D melhorou a distribuição espacial das células endoteliais dentro do suporte polimérico. Este facto, juntamente com a formação em ambiente angiogénico de estruturas similares a microcapilares, forneceu a prova da capacidade deste tipo de estruturas poliméricas em proporcionar a estabilidade estrutural e organizacional para a migração das células endoteliais. O capítulo VI descreveu o desenvolvimento e caracterização de um suporte combinando nanofibras de colagénio com uma malha de micro-fibras SPCL. Esta estrutura é similar à descrita no capítulo anterior (capítulo V), mas em que a rede-nano incorporada é composta por colagénio tipo I. Esta estrutura combinada, incorporando a principal proteína da matriz óssea foi conseguida por uma metodologia de dois passos consistindo em “wet-spinning” seguido de “eletrospinning” de colagénio. O desempenho deste material foi avaliado com monoculturas de osteoblastos (SaOs-2) e células endoteliais isoladas da veia do cordão umbilical (HUVEC). Nas células SaOs-2 verificou-se o aumento da proliferação e um rearranjo diferente do citoesqueleto nas nano-fibras, enquanto que as HUVECs curiosamente exibiram uma organização em estruturas circulares semelhantes à forma das estruturas microcapilares. O último capítulo (capítulo VII) apresenta o resultado de uma estratégia celular complexa consistindo na cultura simultânea de osteoblastos humanos (hOBs) com células endoteliais derivadas da microvasculatura (HDMECs). Provou-se com sucesso que o co-cultivo de hOBs com HDMECs nos suportes de SPCL resultou na formação de estruturas microcapilares. A existência de ramificação, lúmen e da marcação positiva para colagénio tipo IV na região perivascular confirmou a complexidade das estruturas vasculares formadas. Os mecanismos que suportaram e orquestraram este sistema incluem a densa matriz de colagénio tipo I depositada pelos hOBs e que providenciou o suporte físico-químico para a migração das HDMECs; e a comunicação HDMEC:hOBs através do factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e pelo contacto directo através da expressão da proteína de junção connexina-43. Em suma, os resultados apresentados nesta tese fornecem elementos importantes que poderão ser usados na implementação de uma rede vascular em estruturas 3D à base de amido usadas na regeneração óssea.