Osteochondral tissue engineering constructs combining particle aggregated scaffolding and bioactive delivery strategies

Abstract

Osteochondral defects are lesions of the articular cartilage where the underlying bone tissue is also damaged. Although some studies have achieved success in repairing small cartilage defects, there is no widely accepted method for complete repair of large osteochondral defects. This is due to different factors, for instances, the ones associated with mechanical instability, among others. The requirements for a successful regeneration of an osteochondral defect could potentially be met by using a tissue-engineered osteochondral hybrid construct. Therefore, the need for a simultaneous regeneration of both cartilage and subchondral bone should be considered, making osteochondral tissue engineering an interesting challenge to the present research since it requires the combination of both bone and cartilage tissue engineering principles. Some researchers suggest that osteochondral defects could be regenerated from single-layer scaffolds, engineering complex tissue grafts with gradients of molecular, structural, and functional properties. Nevertheless, it has been better accepted that a bilayered structure would be more adequate to regenerate an osteochondral defect. This structure should be able to support the growth and development of different types of cells while providing a mechanical and biochemical environment able to promote the formations of the two distinct tissues. The main goal of this thesis was to develop and assess the potential of several possible strategies for osteochondral tissue engineering. This includes: (1) the development of the cell culturing to be performed independently in the two components that are integrated before implantation; (2) the biphasic scaffold with adequate properties for both cartilage and bone parts to be used in a special bioreactor with two separate chambers where two different cell types can be seeded, and (3) the biphasic scaffold loaded with distinct differentiation agents able to provide the adequate biochemical cues to common progenitor cells. Furthermore, and as a key requisite for biomedical applications including tissue engineering, the presented work also tried to keep present the needs for (4) the in vivo biofunctionality of the new materials. These were the main challenges addressed in this thesis. The work described intends mainly to be yet another positive contribute for the design of a successful approach for osteochondral tissue engineering, having always in mind that, to date, there is no accepted method for complete repair of large osteochondral defects. In this PhD research, an innovative methodology for scaffolds production is proposed, based on the aggregation of prefabricated degradable particles. This methodology allowed to produce scaffolds with high interconnectivity and mechanical stability. The processing route was also used efficiently for the production of bilayered scaffolds by assembling both polymeric and composite particles. The obtained bilayered scaffolds present a very good integration between both components which is critical, since any discontinuity is likely to cause long-term device failure. By using the particles aggregation methodology, and as described in this work, it was possible to successfully produce polymeric, composite and bilayered scaffolds. Chitosan was selected as polymeric matrix due to its structural similarity to glycosaminoglycans (GAGs) found in extracellular matrices including native articular cartilage. On the other hand, hydroxylapatite was used as bioactive ceramic filler, since this it is the main mineral present in bone composition, approaching in this way the developed composite scaffolds to the bone composite structure. An extensive materials characterization was carried out, with a particular emphasis on the morphometric analysis and mechanical performance of the developed materials that have demonstrated to be adequate, corroborating the claimed advantages of the proposed methodology. Preliminary studies with human adipose stem cells were also carried out, clearly indicating the presence of cells with osteogenic and chondrogenic morphology in the 3D particle agglomerated scaffolds. The influence of the 3D support on the cells differentiation ability is further suggested, since no events of osteogenic or chondrogenic differentiation in the control cells without the scaffolds were detected. A specific double-chamber bioreactor was designed in order to allow, as an ultimate goal, for the simultaneous culturing of chondrocytes and osteoblasts or the same source of progenitor cells with distinct differentiation mediums. As proof of concept, dynamic bioactivity tests are described using bilayered chitosan scaffolds. Insulin-loaded chitosan particle aggregated scaffolds are proposed as a potential model system to induce chondrogenic differentiation. The in vitro release profiles and the effect of these systems on a pre-chondrogenic cell line were investigated. The most promising results were obtained for cells seeded in the higher insulin-loaded scaffolds that showed a typical chondrocytic round morphology, were positively stained for toluidine blue, presented a high GAGs production, and expressed genes encoding cartilaginous markers. This approach opens the possibility to assemble the developed systems in bilayered constructs, in order to provide the adequate biochemical cues to promote selective differentiation of cartilage and bone in osteochondral applications. The final study described in this work is focused on the assessment of the in vivo biofunctionality of polymeric chitosan scaffolds. The scaffolds in vivo performance is one obvious key requirement for tissue engineering applications. The scaffolds properties shown to be favourable to the connective tissues ingrowth into the scaffolds, demonstrating a good integration with the host tissue. Furthermore, the scaffolds were able to promote an organization of the extracellular matrix and an increasing neo-vascularization with the time of implantation, which is rather promising and not typical at all for porous biodegradable systems. As a general remark, and in the context of possible strategies for osteochondral tissue engineering, the chitosan-based scaffolds produced by particle aggregation are morphologically and mechanically competent. In addition, the developed scaffolds are able to incorporate adequate biochemical cues, and present an in vivo biocompatible behaviour, and may thereby be potential candidates for large osteochondral tissue engineering applications. Each of the individual performed work opens the possibility to better accomplish an osteochondral hybrid strategy following the different discussed options. This is the main innovation coming from this thesis.

Os defeitos osteocondrais são lesões na cartilagem articular onde o tecido ósseo adjacente está também danificado. Apesar do sucesso alcançado em alguns estudos na regeneração de pequenos defeitos da cartilagem, não existe actualmente um método consensual para a reabilitação completa de grandes defeitos osteocondrais. Isto é devido a diferentes factos, entre os associados com instabilidade mecânica. Os requisitos para uma regeneração bem sucedida de um defeito osteocondral podem ser potencialmente preenchidos utilizando um suporte híbrido desenvolvido através de engenharia de tecidos. Por isso, a necessidade da regeneração simultânea da cartilagem e do osso subcondral deve ser considerada, tornando a engenharia de tecidos osteocondral num desafio interessante para a investigação actual, uma vez que requer a combinação dos princípios de engenharia de tecidos do osso e da cartilagem. Alguns investigadores sugerem que os defeitos osteocondrais podem ser regenerados a partir de suportes monofásicos, desenvolvendo implantes tecidulares complexos com gradientes de propriedades moleculares, estruturais e funcionais. No entanto, tem sido melhor aceite que uma estrutura bifásica pode ser mais adequada para regenerar um defeito osteocondral. Esta estrutura deve ser capaz de sustentar o crescimento e desenvolvimento de diferentes tipos de células, providenciando um ambiente bioquímico e mecânico capaz de promover a formação dos dois tecidos distintos. O principal objectivo desta tese foi desenvolver e avaliar o potencial de várias estratégias possíveis para engenharia de tecidos osteocondrais. Estas incluem: (i) o desenvolvimento de cultura de células para ser efectuado nos dois componentes independentemente que são integrados antes da implantação; (ii) o suporte bifásico com propriedades adequadas para a regeneração de osso e cartilagem é utilizado num bioreactor específico com duas câmaras separadas, onde os dois tipos de células diferentes podem ser cultivados; e (iii) os agentes de diferenciação são incorporados no suporte bifásico, de modo a proporcionar estímulos bioquímicos adequados às células progenitoras comuns. Para além disso, e como um précondição essencial para aplicações biomédicas incluindo engenharia de tecidos, este trabalho tentou ter sempre presente os requisitos de biofuncionalidade in vivo de novos materiais. Estes são os principais desafios propostos nesta tese. O trabalho descrito pretende principalmente ser mais um contributo positivo para o design de uma estratégia de sucesso na engenharia de tecidos osteocondrais, não esquecendo que até à data não existe um método consensual para a reabilitação completa de grandes defeitos osteocondrais. Nesta investigação de doutoramento, é proposta uma metodologia inovadora para a produção de suportes para engenharia de tecidos com base na agregação de partículas biodegradáveis pré-processadas. Esta metodologia permitiu a produção de suportes para engenharia de tecidos com elevada interconectividade e estabilidade mecânica. Mais ainda, foi aplicada eficazmente na produção de suportes bifásicos combinando partículas poliméricas e compósitas. Os suportes bifásicos obtidos apresentam uma boa integração entre os dois componentes. Este facto é crítico, dado que é provável que qualquer descontinuidade provoque a falha do dispositivo a longo prazo. Utilizando a metodologia de agregação de partículas, e tal como é descrito neste trabalho, foi possível produzir com sucesso estruturas poliméricas, compósitas e bifásicas. O quitosano foi seleccionado como matriz polimérica devido à sua semelhança estrutural com os glicosaminoglicanos (GAGs) presentes nas matrizes extra-celulares, incluindo na cartilagem articular. Por outro lado, a hidroxiapatite foi utilizada como reforço cerâmico bioactivo, dado que é o principal mineral presente na composição do osso, aproximando deste modo os materiais compósitos desenvolvidos à estrutura compósita do osso. Uma extensa caracterização dos materiais foi realizada, com particular ênfase na análise morfométrica e desempenho mecânico dos materiais desenvolvidos que demonstraram ser adequados, comprovando assim as vantagens reivindicadas da metodologia proposta. Estudos preliminares com células estaminais do tecido adiposo foram efectuados, indicando claramente a presença de células com morfologia osteogénica e condrogénica nos suportes desenvolvidos. A influência da estrutura tridimensional na capacidade de diferenciação das células é também sugerida, uma vez que não foram detectadas evidências de diferenciação osteogénica e condrogénica nas células sem os suportes utilizadas como controle. Um bioreactor específico de câmara dupla foi também desenhado de modo a permitir, como objectivo final, a cultura simultânea de condrócitos e osteoblastos ou o mesmo tipo de células progenitoras com diferentes meios de diferenciação. Como prova de conceito foram efectuados estudos dinâmicos de bioactividade utilizando suporte bifásicos de quitosano. Suportes produzidos por agregação de partículas carregados com insulina são propostos como um potencial modelo para induzir a diferenciação condrogénica. Os perfis de libertação in vitro e o efeito destes sistemas numa linha celular pré-condrogénica foram investigados. Os resultados mais promissores foram obtidos com células cultivadas nos suportes com maior concentração de insulina tendo as células demonstrado uma morfologia típica de condrócitos e marcado positivamente para o azul de toluidina. Verificou-se também um aumento na produção de glicosaminoglicanos e na expressão de genes associados a marcadores típicos de cartilagem. Esta aproximação abre a possibilidade de associar os sistemas desenvolvidos em suportes bifásicos, fornecendo sinais bioquímicos adequados à promoção selectiva da diferenciação em cartilagem e osso, tendo em vista aplicações osteocondrais. O estudo final descrito neste trabalho foca-se na avaliação da biofuncionalidade in vivo dos suportes poliméricos de quitosano. O comportamento destes materiais in vivo é um pré-requisito óbvio para aplicações no campo de engenharia de tecidos. As propriedades dos suportes mostraram ser favoráveis ao crescimento dos tecidos conectivos para o interior dos mesmos, apresentando uma boa integração com o tecido hospedeiro. Os materiais foram ainda capazes de promover a organização da matriz extra-celular e um aumento da neo-vascularização durante a implantação, o que é bastante promissor e de todo invulgar para sistemas porosos biodegradáveis. Como comentário final, e no contexto de possíveis estratégias para engenharia de tecidos osteocondrais, os suportes à base de quitosano processados por agregação de partículas são morfológica e mecanicamente competentes. Para além disso, os materiais desenvolvidos são capazes de incorporar sinais bioquímicos adequados apresentando um comportamento biocompatível in vivo, podendo deste modo ser considerados potenciais candidatos para aplicações de engenharia de tecidos de grandes defeitos osteocondrais. Cada um dos trabalhos realizados abre uma possibilidade de alcançar uma estratégia híbrida osteocondral tendo em conta as opções discutidas. Esta é a principal inovação resultante desta tese.