Intercellular relationships in the tumor microenvironment: implications for cancer pathophysiology

Abstract

Cancer cells do not manifest the disease alone, but rather recruit and corrupt resident normal cell types to create the tumor microenvironment (TME). Collaborative interactions between neoplastic cancer cells and their supporting stroma leads to chronic proliferation and to the formation of organ-like structures that typify most human tumors. The TME per se is a major driver of intratumor heterogeneity, malignant progression and development of resistance to conventional anticancer therapies. Although this was recognized more than a decade ago, the high complexity of the interactions in the tumor network are far from being fully understood. In this scenario, understanding the crosstalk between the different cellular compartments of the TME, to better understand the biology of the tumors, is crucial for the clinical management of oncologic patients. The research summarized in this thesis focus on the intercellular relationships in the TME and their implications in cancer, adding to the body of knowledge that may incrementally contribute to a better understanding of this devastating group of diseases. The brain has a particular TME, in part because of the specific brain-resident cell types. We initiated our studies by investigating how the paracrine activity of resident glial cells is modulated by brain tumor cancer cells, and how this crosstalk can influence the malignant phenotype of cancer cells. For this, we used glioblastoma (GBM) as a tumor model because it is the most malignant primary brain tumor. A proteomic analysis of the secretome of primary mouse glial cells unexposed or exposed (primed) to the secretome of GBM cells was conducted. The pre-exposure of glial cells to the secretome of cancer cells led to the upregulation of several proteins related to inflammatory response, cell adhesion and extracellular structure organization within the secretome of glial cells. Additionally, GBM cells exposed to the secretome of primed glial cells increased their viability and cell-death resistance, while decreased their migratory capacity. These effects on GBM cells were accompanied by the activation of intracellular cancer-related pathways, mainly the MAPK/ERK pathway, a regulator of cell proliferation. With these results, we showed that glial cells can impact on the pathophysiology of brain tumors, and that the paracrine interactions between cancer cells and neighbouring glial cells regulate the “go-or-grow” phenotype of GBM cells. Besides resident cells, also circulating immune cells that are recruited to the tumor play a crucial role in the TME, reason why escaping from the immune system is a hallmark of cancer. Additionally, the immunosuppressive TME can hamper the efficiency of cancer therapies. Thus, in the second part of this thesis, we explored the potential targeting of an axon-guidance molecule, Plexin A4 (PlxnA4), in the stromal cells to increase anti-tumor immunity. The constitutive deletion of PlxnA4 in the immune system showed to decelerate the tumor growth of several tumor models by increasing the infiltration of cytotoxic T lymphocytes (CTLs), revealing that its expression in immune cells is critical for immunosuppression. Particularly, the loss of PlxnA4 in CTLs increased their migratory capacity as well as their proliferation, being sufficient to re-shape the TME towards a more immunopermissive state. Moreover, the therapeutic use of PlxnA4 deletion in CTLs showed that PlxnA4 targeting can be a potential new anti-tumor immunotherapy that can be used alone or in combination with other cancer therapies. In summary, the work presented in this thesis contributes to a better understanding of the highly complex interactions at the TME, highlighting its remarkable relevance for cancer pathophysiology. Particularly, the characterization of the interaction between glial cells and cancer cells may be relevant to understand brain tumors and metastasis TME, and may be an important tool for the development of new therapeutic approaches. Additionally, the use of targeting strategies involving the inactivation of PlxnA4 in CTLs may be important as a new anti-cancer therapy by re-shaping the immunosuppressive TME.

As células cancerígenas não provocam sozinhas a doença, em vez disso, elas recrutam e modificam células residentes normais para criar o microambiente tumoral. Interações entre as células neoplásicas e o seu estroma de suporte levam a uma proliferação crónica e à formação de estruturas tipo-órgão que caracterizam a maioria dos tumores humanos. O microambiente tumoral per se é um dos maiores impulsionadores da heterogeneidade intratumoral, progressão maligna e desenvolvimento de resistência às terapias convencionais. Embora isso tenha sido reconhecido há mais de uma década, a elevada complexidade das interações tumorais está longe de ser completamente compreendida. Neste cenário, compreender as interações entre os diferentes compartimentos celulares do microambiente tumoral, para melhor compreender a biologia dos tumores, é crucial para a gestão clínica dos pacientes oncológicos. A investigação sumariada nesta tese foca-se nas relações intercelulares no microambiente tumoral e nas suas implicações para o cancro, acrescentando conhecimento que poderá contribuir para uma melhor compreensão deste grupo de doenças devastadoras. O cérebro tem um microambiente tumoral particular, em parte por causa das células que nele residem. No nosso trabalho, começámos por investigar como é que a atividade parácrina das células gliais residentes é modulada pelas células cerebrais tumorais, e como é que essa interação pode influenciar o fenótipo maligno das células tumorais. Para isso, usámos um modelo tumoral de glioblastoma (GBM) porque este é o tumor primário mais maligno do cérebro. Foi realizada uma análise proteómica do secretoma de células primárias de glia não expostas ou expostas (condicionadas) ao secretoma de células de GBM. A pré-exposição das células da glia ao secretoma das células tumorais levou a um aumento de diversas proteínas relacionadas com a resposta inflamatória, adesão celular e organização da estrutura extracelular no secretoma das células da glia. Além disso, células de GBM expostas ao secretoma de células da glia condicionadas aumentaram a sua viabilidade assim como resistência à morte celular, enquanto perderam capacidade de migração. Estes efeitos nas células de GBM foram acompanhados pela ativação de vias intracelulares relacionadas com o cancro, em particular a via MAPK/ERK, uma via que regula a proliferação celular. Com estes resultados, demonstrámos que as células da glia podem ter um impacto na patofisiologia dos tumores cerebrais e que as interações parácrinas entre as células tumorais e as células gliais vizinhas regulam o fenótipo de “migrar-ou-crescer” das células de GBM. Para além das células residentes, também as células imunes que estão em circulação podem ser recrutadas para o tumor, onde desempenham um papel no microambiente tumoral, razão pela qual escapar do sistema imune é uma das características do cancro. Além disso, o microambiente imunossupressor pode dificultar a eficiência das terapias. Assim, na segunda parte desta tese, explorámos a potencial manipulação de uma molécula guia de axónios, a plexina A4 (PlxnA4), nas células do estroma de modo a aumentar a imunidade anti-tumoral. A deleção constitutiva da PlxnA4 no sistema imune mostrou desacelerar o crescimento tumoral em vários modelos através do aumento da infiltração de linfócitos T citotóxicos, revelando que a sua expressão nas células imunes é fundamental para a imunossupressão. Em particular, a perda da PlxnA4 nas células T citotóxicas levou a um aumento da sua capacidade migratória e proliferativa, sendo suficiente para alterar o microambiente tumoral para um estado mais imunopermissivo. Além disso, o uso da PlxnA4 como alvo terapêutico em células T citotóxicas mostrou ter potencial para ser uma nova imunoterapia que pode ser usada como monoterapia ou em combinação com outras terapias contra o cancro. Em suma, o trabalho apresentado nesta tese contribui para um melhor entendimento das complexas interações no microambiente tumoral, salientando a sua extrema importância para a patofisiologia do cancro. Em particular, a caracterização da interação entre as células gliais e as células de glioma pode ser relevante para compreender o microambiente das células tumorais bem como das metástases cerebrais, podendo ser uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Além disso, o uso de terapias envolvendo a inativação da PlxnA4 em células T citotóxicas pode ser importante como uma nova terapia por alterar o microambiente tumoral imunossupressor.