Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/50226

TitleIdentification of human and pathogen molecular variants associated to tuberculosis heterogeneity
Other titlesIdentificação de variantes moleculares do humano e patogénio associados à heterogeneidade da tuberculose
Author(s)Bastos, Hélder Novais
Advisor(s)Saraiva, Margarida
Castro, Rui Manuel Rosário Sarmento
Issue date2017
Abstract(s)Tuberculosis (TB) imposes high human and economic tolls. One of the most striking features of TB is the variability of infection outcomes, which has been classically attributed to environmental and host determinants. More recently, studies uncovering Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) genomic diversity have shown the potential importance of pathogen-related factors to the disease pathogenesis. We approached this question from different angles, by combining the study of the pathogen properties, the host immune response and the clinical features of TB, within a cohort of 681 culture-confirmed pulmonary TB (PTB) cases diagnosed at the Hospital de São João, a major healthcare center in Porto, Portugal, between 2007 and 2013. We started by developing a severity assessment tool for stratifying mortality risk in PTB patients. Five risk features were selected for the prediction model: hypoxemic respiratory failure (OR 4.7, 95% CI 2.8-7.9), age ≥50 years (OR 2.9, 95% CI 1.7-4.8), bilateral lung involvement (OR 2.5, 95% CI 1.4-4.4), ≥1 significant comorbidity – HIV infection, diabetes mellitus, liver failure or cirrhosis, congestive heart failure and chronic respiratory disease – (OR 2.3, 95% CI 1.3- 3.8), and hemoglobin <12 g/dL (OR 1.8, 95% CI 1.1-3.1). A TB risk assessment tool (TReAT) was developed, stratifying patients with low (score ≤2), moderate (score 3-5) and high (score ≥6) mortality risk. The mortality associated with each group was 2.9%, 22.9% and 53.9%, respectively. The model performed equally well in the validation cohort. After focusing on the host clinical prognostic predictors, in the second part of the project we assessed the impact of M. tuberculosis diversity on the disease clinical severity. We started by developing a clinical decision tree to classify the severity of the disease and by applying it to a selected group of 133 individuals that in our cohort did not present known predictor or precipitator TB factors. We found that, for this group of patients, no association existed between the severity of disease and the phylogeny of the infecting bacteria. We also found that M. tuberculosis isolates from patients with mild disease grew significantly slower, while strains associated to moderate outcome had a longer lag phase and reached the highest plateau, after a steep exponential phase. To gain in-depth knowledge of the genetic basis for differential mycobacterial growth, we performed whole genome sequencing analysis. We detected several single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes that were previously associated with growth suppression and identified novel gene candidates involved in membrane transport and biosynthetic pathways. Finally, in the third part of this work, we studied the architecture of the immune response triggered by the different isolates of M. tuberculosis. Sixteen clinical isolates associated with different clinical severity of TB were selected and used to infect peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from nontreated/ non-recent latent TB infected (LTBI) donors or past/cured TB patients. Independently of the host genetics, we identified two distinct groups of M. tuberculosis isolates: high versus low inflammatory triggers. Furthermore, we report that PBMCs from past TB patients produced less IL-1β than those from LTBI participants in response to a variety of isolates, whereas the opposite was observed for IL-1RA. LTBI subjects elicited responses with significantly higher IL- 1β/IL-1RA ratios than those from TB patients, thus suggesting this ratio as a discriminator of risk for latent to active TB progression. Overall, we provide a new clinical prediction rule for the risk of death in TB patients and propose a new classification tree for TB severity. On the pathogen side, we unveiled the differential growth of clinical isolates associated with moderate outcomes of TB as a distinctive feature. On the host side, we suggest the ratio IL-1β/IL-1RA as a possible biomarker of disease resistance versus susceptibility to TB. Our findings present new platforms for active and latent TB management and open new avenues for basic research, to unveil host and pathogen determinants of TB outcomes.
A tuberculose (TB) continua a impor elevados custos económicos e humanos. Uma das características mais notáveis da TB é a variabilidade de resultados da infeção, que tem sido classicamente atribuída a determinantes ambientais e do hospedeiro. Trabalhos mais recentes estudaram a diversidade genómica do Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) e revelaram o potencial impacto dos fatores da bactéria na patogénese da TB. Esta questão foi abordada por diferentes ângulos, combinando o estudo das propriedades do patogénio, a resposta imune do hospedeiro e as características clínicas de TB, a partir de uma coorte de 681 casos de TB pulmonar confirmados por cultura, diagnosticados no Hospital de São João, um centro clínico de excelência do Porto, Portugal, entre 2007 e 2013. Começámos por desenvolver uma ferramenta de avaliação de gravidade clínica para estratificar o risco de mortalidade de doentes com TB pulmonar. Cinco fatores de risco foram selecionados para o modelo de predição: insuficiência respiratória hipoxémica (OR 4.7, 95% CI 2.8-7.9), idade ≥50 anos (OR 2.9, 95% CI 1.7-4.8), envolvimento pulmonar bilateral (OR 2.5, 95% CI 1.4-4.4), ≥1 comorbilidade significativa – infeção HIV, diabetes mellitus, insuficiência hepática ou cirrose, insuficiência cardíaca congestiva e doença respiratória crónica – (OR 2.3, 95% CI 1.3-3.8), e hemoglobina <12 g/dL (OR 1.8, 95% CI 1.1-3.1). Desenvolveu-se a tuberculosis risk assessment tool (TReAT), estratificando doentes com baixo (pontuação ≤2), moderado (pontuação 3-5) e alto (pontuação ≥6) risco de mortalidade. A mortalidade em cada grupo foi de 2.9%, 22.9% e 53.9%, respetivamente. O modelo manteve um bom desempenho na coorte de validação. Após nos termos focado nos preditores clínicos de prognóstico do hospedeiro, na segunda parte do projeto quisemos analisar o impacto da diversidade de M. tuberculosis na gravidade da doença. Desenvolvemos uma árvore de decisão clínica para classificar a gravidade da doença e aplicámo-la a um grupo selecionado de 133 doentes que na nossa coorte não apresentavam fatores preditores ou precipitantes conhecidos de TB. Neste grupo não se verificou uma associação entre a gravidade clínica e a filogenia da bactéria infetante. Porém, mostrámos que os isolados de M. tuberculosis de indivíduos com doença ligeira crescem de forma significativamente mais lenta, enquanto que as estirpes associadas com TB moderada apresentam uma fase lag mais longa e atingem um patamar mais elevado, após uma fase uma íngreme fase exponencial. Para conhecer em detalhe as bases genéticas do crescimento micobacteriano, realizámos uma análise de sequenciação genómica. Detetaram-se diversos single nucleotide polymorphisms (SNPs) em genes que previamente tinham sido associados com a supressão de crescimento e identificámos novos genes candidatos envolvidos no transporte de membrana e em vias biossintéticas. Finalmente, na terceira parte do trabalho, estudámos a arquitetura da resposta imune desencadeada por diferentes estirpes de M. tuberculosis. Dezasseis isolados clínicos associados a diferentes gravidades clínicas de TB foram selecionados e usados para infetar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de dadores com infeção latente não recente e não tratada ou de doentes com TB passada/curada. Independentemente da genética do hospedeiro, identificámos dois grupos distintos de isolados de M. tuberculosis muito e pouco inflamatórias. Além disso, mostrámos que PBMCs de doentes com TB passada produzem menos IL-1β em resposta a uma variedade de isolados, enquanto o oposto se verificou para IL-1RA. Dadores com infeção latente apresentaram respostas com razão IL-1β/IL-1RA significativamente mais elevada. Em suma, propomos uma nova regra de predição clínica para o risco de mortalidade por TB e uma nova árvore de classificação de gravidade da doença. Na vertente do patogénio, desvendámos um perfil de crescimento distinto dos isolados clínicos associados com TB moderada. Na vertente do hospedeiro, os nossos resultados sugerem que a razão IL-1β/IL-1RA poderá ser um biomarcador de resistência versus suscetibilidade para TB. Estes dados fornecem novas plataformas para a investigação básica dos determinantes do hospedeiro e patogénio na heterogeneidade da TB.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de Doutoramento em Medicina
URIhttp://hdl.handle.net/1822/50226
AccessEmbargoed access (2 Years)
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
ICVS - Teses de Doutoramento

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