Antibacterial glass and glass-biodegradable matrix composites for bone tissue engineering

Abstract

Multiple joint and bone diseases affect millions of people worldwide. In fact the Bone and Joint Decade’s association predicted that the percentage of people over 50 years of age affected by bone diseases will double by 2020. Bone diseases commonly require the need for surgical intervention, often involving partial or total bone substitution. Therefore biodegradable biomaterials designed as bone tissue engineered (BTE) devices to be implanted into the human body, function as a short-term template for regeneration of bone defects. They should be biologically active, osteoconductive, strongly bonding to bone tissue, while being osteoinductive, stimulating cell ingrowth and extra cellular matrix (ECM) deposition, leading to bone formation. The huge increase in surgeries to the joint and bone to implant biomedical devices led to an increase on MDAIs. This can lead to the failure of the device, frequently demanding for prolonged usage of antibiotic therapies. Currently, there is a pressing clinical need to develop innovative biomaterials or device surfaces that provide a dual functionality: bone tissue regeneration and inhibition of the proliferation of pathogenic microorganisms. In this thesis it is proposed the development of a system that could be efficiently, and successfully applied as a BTE device. Due to its great potential, the emphasis of the work was on the design of BBGs presenting osteoconductive, osteoinductive and antibacterial properties. BBGs incorporating different divalent cations (i.e. Mg2+, Ca2+, Sr2+) were synthesised and consistently evaluated the influence of the different divalent cations on their cytotoxicity (Chapter III), bioactive and antibacterial (Chapter IV), and osteogenic (Chapter V) potential. It was demonstrated that: i) the controlled crystallisation of BBGs produce glass-ceramics with less cytotoxic effects on cells (i.e. L929 cells); ii) the BBGCa and BBG-Sr glasses are osteoconductive, presenting the ability to form an apatite layer at their surface, whereas the BBG-Mg and BBG-Sr glasses (9, to 72 mg⋅ml-1) present antibacterial properties (specially, BBG-Sr, that was able to eradicate Pseudomonas aeruginosa at concentrations ≥ 18 mg⋅ml-1); and iii) the BBG-Mg and BBG-Sr induced an overexpression of bone-specific proteins (i.e. ALP, OP and OC) and high mineralisation of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) culture under osteogenic media for glass concentrations between 20 and 50 mg⋅ml-1. Outstandingly, BBG-Sr at a concentration of 50 mg⋅ml-1 was able to increase the mineralisation and expression of bone-specific proteins even under basal media conditions. After demonstrating the potential of BBGs to promote the osteogenic differentiation of stem cells and their proliferation, as well as the antibacterial activity of these glass compositions, BBG glass particles were combined with a biodegradable matrix of poly L lactic acid (PLLA) to generate three-dimensional (3D) composite scaffolds as BTE devices. Specifically, the the incorporation of those BBG glass particles into a PLLA fibrous by the wet spinning technique was tested to form PLLA-BBG scaffolds (Chapter IV). It was demonstrated that these composites were biodegradable, bioactive and noncytotoxicity towards human osteosarcoma cell line (SaOs-2) and human adipose-derived stem cells (hASCs). The last experimental chapter (Chapter VII), reports the fabrication of PLLA- strontium containing- BBG (PLLA-BBG-Sr) composite membranes by electrospinning. From this study we verified that the incorporation of BBG-Sr into the PLLA membranes enhanced their mechanical properties (improving Young modulus and tensile strength) and increased the degradability with a continuous release of ions and water uptake. Furthermore, cellular in vitro evaluation with BM-MSCs demonstrated that the develop PLLA-BBG-Sr membranes stimulated alkaline phosphatase (ALP) activity and up-regulated osteogenic related gene expression (i.e. Alpl, Sp7 and Bglap) under osteogenic culture conditions promoting the osteogenic differentiation of BM-MSCs. The results presented in thesis show that BBGs and the biodegradable PLLA-BBG composites present the capacity of actively enhancing cell adhesion, proliferation and osteogenic differentiation, as well as controlling bacterial infections. Moreover, the reinforcement of PLLA membranes with BBG show great potential to achieve an effective biomedical device for bone regeneration.

Doenças ósseas e de articulações afectam milhões de pessoas por tudo o mundo. De facto, a associação Bone and Joint Decade’s prevê que o número de pessoas com idades superiores a 50 anos afectadas por doenças ósseas vá aumentar para o dobro até 2020. Este tipo de doenças requer normalmente intervenção cirúrgica com substituição parcial ou total do osso. A engenharia de tecidos ósseos (ETO) utiliza materiais biodegradáveis para criar dispositivos implantáveis no corpo humano, funcionando como suporte temporário ao passo que regeneram o osso. Estes biomateriais devem ser: osteocondutores, ligando-se fortemente aos tecidos ósseos; e osteoindutores, estimulando o crescimento celular e deposição de matriz extra celular para a formação de novo osso. O aumento do número de intervenções cirúrgicas está diretamente relacionado com um elevado número de infecções associadas a implantes ósseos (IAIO), que pode levar ao uso prolongado de antibióticos ou à rejeição do implante. Atualmente existe uma grande necessidade de desenvolver biomateriais e dispositivos médicos que possuam a dupla funcionalidade: regeneração óssea e inibição de proliferação de microrganismos. O objectivo deste projeto de doutoramento é desenvolver um dispositivo médico baseado nos princípios ETO. Devido ao seu grande potencial, o enfâse deste trabalho focou no desenvolvimento de vidros bioactivos com matriz de borossilicatos (BBGs) dotados com propriedades osteocundutoras, onsteoindutoras e antibacterianas. BBGs com diferentes catiões bivalentes incorporados (ex. Mg2+, Ca2+, Sr2+) foram sintetizados e sistematicamente avaliados quanto à sua influência relativamente ao seu potencial citotóxico (Capítulo III), antibacteriano (Capítulo IV) e osteogénico (Capítulo V). Foi demostrado: i) que uma cristalização controlada dos vidros origina vidro-cerâmicos com menores efeitos citotóxicos para as células (ex. L929); ii) que BBG-Ca e BBG-Sr revelaram grande capacidade osteocondutora, apresentando a formação de camadas de apatite na sua superfícies, e que BBG-Mg e BBG-Sr (9–72 mg⋅ml-1) exibiram propriedades antibacterianas (especialmente, BBG-Sr que foi capaz de erradicar Pseudomonas aeruginosa para concentrações ≥ 18 mg⋅ml-1); e iii) BBG-Mg e BBG-Sr induziram a superexpressão de proteínas específicas do osso (ex. ALP, OP e OC) com elevada mineralização das células estaminais da medula óssea (BM-MSCs) cultivadas em meio osteogénico com concentrações entre 20 e 50 mg⋅ml-1. De forma extraordinária, BBG-Sr a concentrações de 50 mg⋅ml-1 demonstrou capacidade de mineralização e expressão de proteínas específicas do osso mesmo em meio de cultura basal. Após demonstrada a capacidade antibacteriana, de promover a diferenciação osteogénica de células estaminais e a sua proliferação; as partículas de BBG foram combinadas com uma estrutura polimérica degradável de ácido poli-L-láctico (PLLA) para o fabrico de compósitos tridimensionais (3D). A incorporação dessas partículas BBG numa estrutura fibrosa de PLLA através de técnica extrusão húmida foi testada para o fabrico de compósitos PLLA-BBG (capítulo IV). Foi demonstrado também que estes compósitos são biodeagradáveis, com grande capacidades bioactivas, não apresentando citotoxicidade em cultura com células osteoblásticas derivadas de osteossarcoma humano (SaOS-2), bem como com células humanas estaminais derivadas de tecido adiposo (hASCs). O último capítulo experimental (Capítulo VII), descreve o fabrico de membranas compostas por PLLA – vidros bioactivos borossilicatos com estrôncio (PLLA-BBG-Sr) através da técnica de electro-fiação. Após este estudo verificamos que a incorporação de partículas de vidro BBG-Sr nas membranas PLLA provoca um incremento das suas propriedades mecânicas (aumento de módulo de Young e da resistência à tração) bem como um aumento da degradabilidade com uma contínua libertação de iões e absorção de água. Para além disso, estudos in vitro com BM-MSCs demonstraram que as membranas de PLLA-BBG-Sr tem a capacidade de estimular a atividade da fosfatase alcalina (ALP) e superexpressar genes específicos do osso (ex. Alpl, Sp7 e Bglap) em condições de culturas osteogénicas, promovendo a diferenciação osteogénica das BM-MSCs Os resultados deste projeto de doutoramento demonstram que partículas de vidro BBG e os compósitos biodegradáveis PLLA-BBG têm uma enorme capacidade de suportar e ativamente aumentar a adesão, proliferação celular e diferenciação osteogénica, bem como controlar infecções bactérias ósseas. Além do mais, o reforço das membranas de um PLLA com a adição de partículas de vidro BBG demonstrou enorme potencial para o desenvolvimento de dispositivos biomédicos para a regeneração de tecidos ósseos.