The impact of non-coding alterations in glioma: hints from HOTAIR and the TERT promoter

Abstract

Gliomas are the most common type of primary malignant brain tumor, and are a significant cause of cancer-associated morbidity and mortality. They are highly heterogeneous tumors, ranging from benign to highly malignant. Critically, attempts to develop curative therapies for high-grade gliomas have been unsuccessful thus far. Additionally, the etiology of glioma remains uncertain, and clinically relevant molecular prognostic factors are scarce. Mutations in IDH1/2 genes and MGMT promoter methylation status are among the most well-established biomarkers of glioma. Yet, the continuous characterization of their landscape in glioma may impact on patients’ stratification into prognostic or therapy response groups, and largely improve their management in the clinic. The discovery that only ~1.5% of the genome encodes for proteins triggered interest in disease-related functions and clinical significance of non-coding RNA (ncRNA) transcripts and regions. Non-coding regions are now viewed as fundamental genetic regulatory elements, with deregulated roles in cancer. In addition to contributions to cancer risk, noncoding regions have proven to be prognostically valuable and possible therapeutic targets. The research work presented here aimed to unveil the relevance of the long non-coding RNA (lncRNA) HOTAIR in glioma susceptibility, the mechanisms regulating HOTAIR expression activation, and its clinical significance in glioma patients. Lastly, a study in a different noncoding DNA element scrutinized the activation mechanism of the mutant TERT promoter via GABP, in addition to the transcriptomic and phenotypic consequences of its blockade, which may have therapeutic implications for glioma and a variety of other human cancers. The importance of inherited genetic variants in glioma risk has been highly studied, and several variants in single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been found to confer risk. Here, two SNPs in the oncogenic lncRNA HOTAIR, rs920778 and rs12826786, were assessed for association with glioma risk, patient prognosis, and HOTAIR expression, using data from 177 Portuguese glioma patients and 199 cancer-free controls. Our results showed similar distributions of these SNP variants between glioma patients and controls, suggesting no associations with glioma risk. No differences in HOTAIR expression levels were found for rs920778 variants. In contrast, the rs12826786 CT genotype was associated with increased intra-tumor HOTAIR levels in comparison to TT genotype. Importantly, both rs920778 CT and rs12826786 CT genotypes associated with longer overall survival in WHO grade III anaplastic oligodendroglioma, and may thus be novel important prognostic factors in these patients. High levels of HOTAIR expression were previously associated with poor prognosis and higher glioma grades. Describing the elusive mechanisms underlying HOTAIR’s aberrant expression might hint for innovative therapeutic rationales. Our data indicated that HOTAIR was highly expressed in a subset of glioblastomas in a gene copy number-independent manner, while DNA methylation levels of particular CpGs in HOTAIR locus associated with its expression levels. We found frequent co-expression of HOTAIR and HOXA9 in high-grade gliomas; mechanistically, HOXA9 directly bound to HOTAIR promoter region and induced its transcription. We validated that high HOTAIR expression was associated with shorter overall survival of glioma patients in multiple datasets. Thus, HOTAIR may be a valuable prognostic factor in glioma patients, and targeting its regulators may prove therapeutically valuable. TERT promoter mutations (C2288T and C250T) are the most prevalent mutations in cancer, thus far detected in over 50 cancer types. Re-activation of TERT expression due to promoter mutations allows cancer cells to gain replicative immortality. The most promissing mechanism of activation is via the GABP binding to the de novo ETS motifs formed by the mutations. GABP is an obligatory multimer, acting as a dimer or a tetramer, depending on which GABPβ isoforms are incorporated into the complex. It was unclear whether the dimeric or tetrameric forms activate the mutant TERT promoter. Here, we show that the genetic disruption of GABPβ1L, a tetramer-forming isoform of GABPβ, resulted in TERT silencing in a TERT promoter mutation-dependent manner. GABPβ1L reduction resulted in telomere dysfunction, DNA damage, and mitotic cell death exclusively in TERT promoter mutant cells. Exogenous expression of TERT was sufficient to prevent telomere degradation and loss of cell viability. These results suggest targeting GABPβ1L as a promising strategy to reduce telomerase activity and improve prognosis in TERT promoter-mutant glioblastoma patients, and possibly many other TERT promoter-mutated cancers. In summary, the work presented here contributes to the better understanding of the remarkable relevance of non-coding regions in glioma pathophysiology. Assessing HOTAIR expression levels and SNP rs920778 and rs12826786 variants may be clinically relevant for glioma patients (as well as targeting its upstream activators, like HOXA9), and targeting GABPβ1L may be a novel and valuable therapeutic approach in glioma and other cancers.

Os gliomas são o tipo de tumor cerebral maligno mais comum, associados a elevada morbilidade e mortalidade. Estes são um tipo de tumor muito heterogéneo, e podem ser benignos ou altamente malignos. Até agora, os esforços para desenvolver terapias curativas para os gliomas têm fracassado. Além disto, a origem da doença permanece indeterminada, e os marcadores moleculares de prognóstico relevantes na clínica são escassos. As mutações nos genes IDH1/2 e o estado de metilação do promotor do MGMT são os biomarcadores melhor estabelecidos. Ainda assim, caracterizar novos marcadores pode ser relevante na estratificação dos pacientes com glioma em grupos com prognóstico ou resposta à terapia semelhantes, poderá melhorar o seu melhor acompanhamento clínico. A descoberta de que apenas ~1.5% do genoma humano codifica para proteínas suscitou interesse nas funções e no significado clínico de transcritos de RNA não-codificante e de regiões não-codificantes no contexto do cancro. Atualmente, estas regiões são vistas como elementos regulatórios fundamentais na doença. Para além de importantes no risco para desenvolver cancro, as regiões não-codificantes têm valor prognóstico e podem ser alvos terapêuticos. O trabalho de investigação aqui apresentado pretendeu perceber quais os papéis do RNA longo não-codificante (lncRNA) HOTAIR no risco para desenvolver glioma, quais os mecanismos que ativavam a sua expressão e a relevância clínica em pacientes com glioma. Por último, um estudo num outro elemento não-codificante, tencionou investigar o mecanismo de ativação das mutações do promotor do TERT pelo complexo GABP, assim como as consequências transcriptómicas e fenotípicas do seu bloqueio. Os polimorfismos genéticos têm sido associados com aumento do risco para desenvolver glioma. Neste trabalho, foram estabelecidas associações entre dois polimorfismos genéticos, rs920778 e rs12826786, no lncRNA HOTAIR e o risco de glioma, o prognóstico dos pacientes e a expressão do HOTAIR em 177 pacientes Portugueses com glioma e 199 controlos sem cancro. Os nossos resultados mostraram uma distribuição semelhante das variantes polimórficas entre pacientes com glioma e os controlos, indicando ausência de associação com o risco. Não foram encontradas associações entre a expressão de HOTAIR e as variantes do rs920778, enquanto a variante CT do rs12826786 foi associada com aumento da expressão intratumoral de HOTAIR em comparação com o genótipo TT. De realçar, as variantes CT de ambos os polimorfismos foram associadas com o aumento da sobrevivência dos pacientes com oligodendroglioma anaplásico (grau III da OMS), podendo estes ser fatores de prognóstico importantes nestes pacientes. A expressão aumentada do HOTAIR nos gliomas foi associada com pior prognóstico destes pacientes. Identificar os mecanismos subjacentes à expressão anormal de HOTAIR poderá indicar novos racionais terapêuticos. Nós mostramos a elevada expressão do HOTAIR num subgrupo de glioblastomas, independente do número de cópias do gene, enquanto os níveis de metilação de ilhas CpG do HOTAIR se associaram com a sua expressão. Verificamos a coexpressão frequente dos genes HOTAIR e HOXA9 em gliomas de alto grau; o mecanismo implica que HOXA9 se liga à região promotora do HOTAIR e induz a sua expressão. Também validamos que a elevada expressão de HOTAIR se associa com a reduzida sobrevivência dos pacientes. Assim, o HOTAIR pode ser um fator de prognóstico importante em pacientes com glioma, e usar os seus reguladores como alvos terapêuticos pode ser relevante na clínica. As mutações do promotor do TERT (C2288T and C250T) são as mais prevalentes em cancro. A reativação da expressão do TERT devido a estas mutações permite que as células tumorais adquiram imortalidade replicativa. O mecanismo de ativação mais promissor é via a ligação do complexo GABP às sequências criadas pelas mutações, que se assemelham aos locais de ligação da família ETS. O GABP atua como um complexo, na forma de dímero ou de tetrámero, dependendo da isoforma da GABPβ incorporada. O tipo de complexo responsável pela ativação destas mutações permanecia desconhecido. Nós mostramos que a disrupção genética da GABPβ1L – isoforma envolvida na formação do tetrámero – resultou na redução de TERT exclusivamente na presença das mutações. Tal levou à atrição dos telómeros, danos no DNA e catástrofe mitótica exclusivamente em células com mutações do promotor do TERT. Estes resultados sugerem a GABPβ1L como um alvo terapêutico na diminuição da atividade da telomerase de forma a melhorar o prognóstico dos pacientes com glioblastoma, e possivelmente muitos outros, com mutações no promotor do TERT. Em suma, os nossos resultados contribuem para o melhor entendimento da importância de regiões não-codificantes na patofisiologia do glioma. Avaliar os níveis de expressão do HOTAIR e as variantes dos SNPs rs920778 e rs12826786 pode ser clinicamente relevante para pacientes com glioma, e a GABPβ1L pode ser um novo e valioso alvo terapêutico em glioma e potencialmente outros cancros.