Antimicrobial peptide combinations against major infectious pathogens: in vitro and in silico approaches

Abstract

Microbiology research has been investing significant efforts in the development of new and effective antimicrobial therapies against the growing number of multiresistant pathogens. Notably, the use of natural compounds, such as antimicrobial peptides (AMP), and the combination of different antimicrobials are being increasingly explored as means to improve individual agent actions while minimising microorganism resistance. This work contributes to these lines of research by investigating the potential of combining the actions of AMP with those of other agents against major infectious pathogens. To do so, this PhD project encompassed a twofold approach: the comprehensive in silico characterisation of existing experimental results on AMP combinations through bioinformatics approaches, and the in vitro (laboratorial) study of novel combinations. The in silico approach outputted a semi-automated curation workflow that supported the mining of scientific literature on AMP-related combinations and enabled the reconstruction of antimicrobial combination networks. Such reconstruction allowed the creation of a public database on AMP-related combinations (http://sing.ei.uvigo.es/antimicrobialCombination/) and sustains its update. Currently, this database contains data on antimicrobial combinations that have been experimentally tested against major pathogenic bacteria and fungi. Records describe species, strains, combination effects, testing methodologies, mode of growth, and expert observations. Researchers may explore the experimental findings for one or more organisms and look into indirect associations so to identify combinations with promising antimicrobial effects that justifies new testing. An adaptation of this workflow was further used to retrieve information on combinations involving three wellknown and FDA approved AMP, colistin (CST), polymyxin B (POL-B) and nisin (NIS). In-depth analysis of these combinations disclosed important observations on the potential of these peptides and their combination, namely in terms of their cellular targets and treated species. This information was also included in the database, which now includes a total of 3111 combinations, encompassing 350 AMP and 337 non- AMP agents. In the in vitro approach, and after a preliminary screening using a battery of AMP, CST was selected to be combined with three other AMP, namely temporin A (TEMP-A), citropin 1.1 (CIT-1.1) and a linear analogue of tachyplesin I (TP-I-L). These CST combinations were studied for their efficacy to prevent (prophylactic approach) or treat (therapeutic approach) planktonic and biofilm cultures of P. aeruginosa and S. aureus. These tests included single- and double-species biofilms, in order to mimic a more real-like infection, and also encompassed three strains for each species, comprising multi-resistant ones. The results from the in silico approach served as confirmation of these untested AMP combinations and the relevance of the two chosen pathogenic species, therefore bridging the gap between the two approaches. Results from the checkerboard assay showed overall synergy for planktonic P. aeruginosa and synergy/additiveness for planktonic S. aureus. The treatment of established 24 h-old biofilms was more difficult than the prevention of biofilm growth, especially for S. aureus and double-species biofilms. Nevertheless, synergic and additive outcomes were observed for higher concentrations, including for the doublespecies biofilms of multi resistant strains. Live/Dead inspection of the treated doublespecies biofilms revealed a substantial lack of cell vitality, which further strengthened the cells viability results. CST was less cytotoxic than the other peptides towards mammalian fibroblasts, but its combination was toxic for high concentrations. Ongoing work is tackling this toxicity issue, e.g. by combining AMP with matrix disrupting enzymes (MDE) such as DNAse I. Overall, CST-AMP combinations were able to reduce effective concentrations of each drug and highlighted the promise that lays in antimicrobial combination strategies to treat polymicrobial biofilm related infection. The outcomes derived from the two different approaches followed in this PhD project were complementary to each other, with the database aiding in the selection of the AMP combinations and species to be tested in vitro, which in turn outputted valuable information to be added to the database. Globally, the use of the two-fold approach (in silico + in vitro) in the AMP-combination study allowed not only the creation of an important resource for other researchers in the same field, but also pointed out AMP combinations that were deemed promising in the treatment of double-species biofilms of relevant pathogens.

Nos últimos anos, a Microbiologia tem investido amplos esforços no desenvolvimento de novas e eficazes terapias antimicrobianas contra o número crescente de patogénicos multirresistentes. Notavelmente, o uso de compostos naturais, como os péptidos antimicrobianos (AMP), e a combinação de diferentes antimicrobianos têm sido bastante explorados como meios de melhorar a acção individual dos compostos e ao mesmo tempo minimizar o desenvolvimento de resistência. Este trabalho contribui para estas linhas de investigação ao estudar o potencial na combinação de AMP com outros compostos contra importantes microrganismos patogénicos. Com esta finalidade, este projecto de doutoramento utilizou uma dupla abordagem: a caracterização sistemática dos resultados experimentais existentes na literatura científica sobre combinações de AMP recorrendo a métodos bioinformáticos (in silico); e o teste laboratorial de novas combinações de AMP (in vitro). Da abordagem in silico resultou o desenvolvimento de uma ferramenta de curação semi-automática que suportou a extracção de informação da literatura científica sobre combinações de AMP e permitiu a reconstrução de redes de combinações antimicrobianas. Esta reconstrução permitiu, por sua vez, a criação de uma base de dados pública sobre o tema (http://sing.ei.uvigo.es/antimicrobialCombination/), possibilitando, também, a sua actualização. Actualmente, esta base de dados contêm informação sobre combinações de AMP testadas em importantes bactérias e fungos patogénicos, com detalhes sobre espécies, estirpes, efeito das combinações, métodos, modo de crescimento, e observações pertinentes. Os utilizadores podem explorar esta informação para um ou mais organismos e perceber associações indirectas entre os agentes de modo a identificar novas combinações a serem testadas. Esta ferramenta foi ainda adaptada para colecionar informação sobre combinações de três AMP aprovados pela FDA: colistina (CST), polimixina B (POL-B) e nisina (NIS). A análise destas combinações originou novas observações sobre o potencial destes AMP e das suas combinações, nomeadamente em termos de alvos celulares e espécies susceptíveis. Esta informação está também incluída na base de dados, que actualmente engloba um total de 3111 combinações, 350 AMP e 337 agentes antimicrobianos. Na abordagem in vitro, e após um teste preliminar a vários AMP, a CST foi seleccionada e combinada com outros três AMP, temporina A (TEMP-A), citropina 1.1 (CIT-1.1) e um análogo linear da taquiplesina I (TP-I-L). A eficácia destas combinações na prevenção (profilaxia) ou tratamento (terapêutica) de culturas planctónicas e de biofilmes de P. aeruginosa e S. aureus foi testada. Estes testes incluíram biofilmes de uma e duas espécies (mistos), mimetizando melhor uma infecção, e também três estirpes para cada espécie, inclusive estirpes multirresistentes. Os resultados in silico confirmaram a utilidade do teste destes AMP e a relevância dos microorganismos selecionados. De modo geral, os resultados dos ensaios em planctónico mostraram sinergia para P. aeruginosa e sinergia/aditividade para S. aureus. O tratamento dos biofilmes pré-estabelecidos foi dificultado relactivamente à prevenção do seu crescimento, especialmente para S. aureus e para os biofilmes mistos. Ainda assim, foi observada sinergia e aditividade para as concentrações mais altas de AMP, incluindo nos biofilmes mistos de estirpes multirresistentes. O ensaio de Live/Dead revelou ausência de vitalidade dos biofilmes mistos sujeitos a tratamento, o que reforçou os resultados obtidos em termos de viabilidade celular. A CST foi menos citotóxica que os outros AMP para fibroblastos de mamífero, mas as suas combinações foram tóxicas para as concentrações mais altas. Presentemente, estão a ser estudadas soluções para esta citotoxicidade, ex. combinações de AMP com enzimas disruptivas da matriz, como a DNAse I. Resumindo, as combinações CSTAMP reduziram as concentrações eficazes de cada AMP e por isso ilustram o potencial do uso de estratégias de combinações de antimicrobianos para o tratamento de infecções relacionadas com biofilmes mistos. Os resultados das duas abordagens deste trabalho foram integrados, com a base de dados a confirmar a selecção dos AMP e espécies testados in vitro, que por sua vez resultaram em nova informação a ser adicionada a esta. Globalmente, o uso desta abordagem dupla (in silico + in vitro) no estudo de combinações de AMP permitiu não só a criação de um importante recurso para outros investigadores da área, mas também permitiu a selecção de combinações de AMP que se revelaram promissoras no tratamento de biofilmes mistos de patogénicos relevantes.