Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/45828

TitleDevelopment of skin equivalents and their characterization for in vitro testing
Other titlesDesenvolvimento de um modelo 3D de pele e a sua caracterização para testes in vitro
Author(s)Gonçalves, Anabela Ferreira
Advisor(s)Gomes, Andreia
Matamá, Maria Teresa Gonçalves Macedo
Issue date4-May-2017
Abstract(s)Skin is the major organ of the human body and its function is to protect the organism from the environment, constituting a very “impermeable” hydrophobic barrier. This is mainly accomplished by a very specialized avascular external layer – the epidermis followed by the dermis. The epidermis is subdivided in several layers representing different stages of keratinocyte differentiation that is accomplished by their continuous proliferation supported by the dermis, keratinization and death. 2D cell cultures, used worldwide, fail to reproduce the very relevant complexity of in vivo skin microenvironment. Thus, the development of in vitro 3D models that mimic more closely the natural skin architecture is of great relevance. They have become a very important tool as skin research models since the use of animals has been restricted due to ethical issues. The purpose of our work is to develop and validate a noncommercial skin equivalent in our laboratory. In order to accomplish the proposed aim, collagen was extracted from chicken and pig skins using an acid/alkali/enzymatic conjugation method and their performances were compared with commercial calf skin and rat tail collagens. All collagens were characterized by electrophoresis, protein and collagen quantification. After polymerization, the collagens were compared in terms of fibroblast proliferation (BJ-5ta cell line). Optimization experiments were performed. The best pore size of the membrane inserts was defined as 1.0 μm in order to assure the best conditions for fibroblast proliferation. The best fibroblast initial seeding density in the collagen matrices was defined as 6x105 cells/ml. The best collagen concentration for the models development was 3 mg/ml. To validate them, the differentiation of keratinocytes (HaCaT cell line) was evaluated by HE staining and by immunohistochemistry for the expression of keratins 10 and 14 (K10/14 – keratinocyte differentiation markers). For rat and calf collagen matrices, 3 to 5 layers of epidermis were observed and K10 expression was essentially present in the supra-basal layers. K14 had a more uniform expression across the keratinocyte layers, however is less expressed in the outermost layers. Models developed with chicken and pig collagen matrices presented only 1 to 2 discontinuous and disorganized layers. Thus, the rat tail and calf skin collagens proved to be the best choices for the development of a skin equivalent. A better optimization of the collagen extraction protocol is required, and the addition of a biopolymer, such as elastin, to our skin equivalents would also be interesting. Due to the numerous advantages that 3D models present, we believe it is important to continue this work.
A pele é o maior órgão do corpo humano e tem por função proteger o nosso organismo do meio ambiente, constituindo uma barreira hidrofóbica muito “impermeável”. Barreira essa composta por uma camada externa avascular muito especializada - a epiderme seguida da derme. A epiderme está subdividida em diversas camadas que representam diferentes estágios da diferenciação dos queratinócitos que é adquirida pela sua proliferação contínua suportada pela derme, queratinização e morte. As culturas celulares 2D, usadas mundialmente, falham na reprodução da complexidade da pele in vivo. Assim, o desenvolvimento de modelos 3D in vitro que imitam a arquitetura do tecido natural é de grande importância. Tornaram-se pois uma ferramenta importante como modelos de investigação, já que o uso de animais foi restringido devido a questões éticas. O objetivo do nosso trabalho é desenvolver e validar um modelo 3D de pele não comercial no nosso laboratório. De forma a cumprir o objetivo proposto, foi extraído colagénio da pele de galinha e porco usando a conjugação de métodos ácido/básico/enzimático e as suas performances foram comparadas com colagénios comerciais de pele de vitela e cauda de ratazana. Todos os colagénios foram caracterizados através de eletroforese, quantificação de proteína e colagénio. Após polimerização, foram comparados relativamente à proliferação dos fibroblastos (linha celular BJ-5ta). Foram realizadas experiências de otimização. O melhor tamanho de poro do insert foi definido como 1.0 μm de forma a assegurar as melhores condições para a proliferação dos fibroblastos. A melhor densidade celular de fibroblastos a plaquear nas matrizes de colagénio foi definida como 6x105 cél/ml. A concentração do colagénio mais adequada para desenvolver os modelos é 3 mg/ml. Para validá-los, a diferenciação dos queratinócitos (linha celular HaCaT) foi avaliada através da marcação com HE e por imunohistoquimica para a expressão da queratina 10 e 14 (K10/14 – marcadores de diferenciação de queratinócitos). Para matrizes de colagénio de ratazana e vitela, 3 a 5 camadas da epiderme foram observadas onde a expressão da K10 estava essencialmente presente nas camadas supra basais. A K14 teve uma expressão uniforme através das camadas de queratinócitos, contudo está em menor quantidade nas camadas mais externas. Modelos desenvolvidos com matrizes de galinha e porco apresentam apenas 1 a 2 camadas descontínuas e desorganizadas. Assim, os colagénios de cauda de ratazana e pele de vitela provaram ser a melhor escolha para o desenvolvimento de um modelo 3D de pele. Uma melhor otimização do protocolo de extração de colagénio é necessária e a adição de um biopolímero, como a elastina, ao nosso modelo poderá ser interessante. Devido às inúmeras vantagens que os modelos 3D apresentam, acreditamos que é importante continuar este trabalho.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado em Genética Molecular
URIhttp://hdl.handle.net/1822/45828
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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