Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/1822/45648

TítuloRole and regulation of katanin in C.elegans embryo
Autor(es)Dias, Ana Beatriz Couto Marques
Orientador(es)Paiva, Sandra
Pintard, Lionel
Data10-Jan-2017
Resumo(s)Meiosis and Mitosis are two different types of cell divisions required for the correct development and reproduction of multicellular organisms. Mitosis ensures cell proliferation and tissue growth and comprises several phases. Meiosis is responsible for haploid gametes formation, necessary for reproduction of diploid organisms, ensuring offspring. It occurs in two phases, meiosis I and meiosis II. In C. elegans, mitosis and meiosis happen in the same cytoplasm separated by twenty minutes, what requires a tight special and temporal regulation. In this worm, meiosis to mitosis transition is regulated through an AAA+ ATPase called katanin. This protein is a microtubule severing protein that needs to be active in meiosis in order to form and assemble a correct meiotic spindle but must be degraded before mitosis. Katanin is composed by two subunits, MEI-1 and MEI-2 and the complex inactivation relies on MEI-1 degradation. Although the importance of katanin in meiosis is well known, its degradation process is not completely understood. So far is known that MBK2 kinase phosphorylates MEI-1 on S92 residue and this phosphorylation happens prior to MEI-1 degradation. Also, after MBK-2 phosphorylation, MEI-1 is recognized by MEL-26, a substrate recognition protein from CUL-3 E3 ligase. This leads to ubiquitin-mediated MEI-1 degradation by proteasome 26. The main gold of this work was to study MEI-1 degradation process and understand if the phosphorylation of S92 would be necessary and sufficient to target MEI-1 for its degradation. In order to achieve that, transgenic lines were created (FLAG::mei-1R(S92A), MEI-1 couldn’t be phosphorylated and FLAG::mei-1R(S92D), MEI-1 would mimic phosphorylation). These mutated strains and N2 strain (WT) were grown in mei-1(RNAi) and also in mei-1/mel-26(RNAi). The phenotypes of these strains, were analyzed and FLAG::mei-1R (S92A) showed the highest levels of mitotic defects, comparing with N2 (WT) and FLAG::mei-1R(S92D), in mei-1(RNAi). Such defects, as spindle positioning defects or cytokinesis regression, would result from an accumulation of MEI- 1 in mitosis. These evidences indicate that the phosphorylation process on S92 residue is, indeed, necessary to target MEI-1 for its degradation. When comparing these results with the phenotype displayed by strains grown on mei-1/mel-26 (RNAi), FLAG::mei-1R(S92A) is still the strain showing highest percentage of mitotic defects. However, in this condition, all the strains displayed a notorious increase in the percentage of mitotic defects. Since inactivating MEL-26 increases the mitotic defects observed, we concluded that S92 phosphorylation is necessary but likely not sufficient to target MEI-1 for degradation.
A meiose e a mitose são duas divisões celulares diferences requeridas para um correto desenvolvimento e reprodução dos organismos multicelulares. A mitose assegura a proliferação celular e o crescimento dos tecidos e consiste em diversas fases. A meiose é responsável pela formação dos gametas haploides, necessária à reprodução dos organismos diploides, assegurando descendência. Divide-se em meiose I e meiose II. No C. elegans, a mitose e a meiose acontecem no mesmo citoplasma separadas por vinte minutos, o que requere uma forte regulação espacial e temporal. Neste verme, a transição da meiose para a mitose é regulada por uma AAA+ ATPase chamada katanina. Esta proteína é uma proteína que corta os microtúbulos e cuja ativação é necessária para que haja uma correta formação e posicionamento do fuso meiótico, mas cuja inativação é requerida antes da mitose. Esta proteína é composta por duas subunidades, MEI-1 e MEI-2, e a sua inativação passa pela degradação de MEI-1. Ainda que a importância da katanina na meiose seja um facto conhecido, o seu processo de degradação não é completamente compreendido. Sabe-se a cinase MBK-2 fosforila a subunidade MEI-1 na Serina92, sendo que esta fosforilação antecede a degradação da MEI-1. Após esta fosforilação, a proteína MEI-1 é reconhecida pela MEL-26, uma proteína reconhecedora de substratos que faz parte da E3 ligase CUL-3. Este reconhecimento resulta na degradação da MEI-1 por ubiquitinação, através do proteassoma 26S. O objetivo principal deste trabalho era estudar o processo de degradação da MEI-1, tentando perceber se a fosforilação de S92 é necessária e suficiente para a degradação da MEI-1. Para isso, foram criadas espécies transgénicas de nematode com a serina 92 mutada (FLAG::mei-1R (S92A), MEI-1 não pode ser fosforilada) e por um ácido aspártico (FLAG::mei-1R(S92D), MEI-1 mimica a fosforilação). Estas novas espécies, juntamente com N2 (WT), foram crescidas em mei-1(RNAi) e também em mei-1/mel-26(RNAi). Os fenótipos destas espécies, foram avaliados e viu-se que FLAG::mei-1R (S92A) mostrou a maior percentagem de defeitos na mitose, comparativamente com N2 e FLAG::mei-1R(S92D). Estes defeitos, como posicionamento defeituoso do fuso mitótico ou regressão da citocinese, resultaram da acumulação de MEI-1 na mitose. Isto indica que, de facto, a fosforilação da serina92 é necessária para a degradação da MEI-1. Comparando estes resultados com o fenótipo obtido das mesmas espécies crescidas em mei-1/mel-26(RNAi), FLAG::mei-1R (S92A) continua a ser a espécie com mais defeitos na mitose. Todavia, nesta condição, todas as espécies mostraram um aumento significativo da percentagem dos defeitos verificados na mitose. Tendo em conta que a inativação da MEL-26 leva a um aumento dos defeitos verificados, possivelmente devido a uma maior acumulação de MEI-1, concluímos que a fosforilação da serina 92 é necessária, mas, provavelmente, não é suficiente para desencadear a degradação da MEI-1.
TipomasterThesis
DescriçãoDissertação de mestrado em Genética Molecular
URIhttp://hdl.handle.net/1822/45648
AcessorestrictedAccess
Aparece nas coleções:DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses
BUM - Dissertações de Mestrado

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