Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by peptides from the pro domain region of the BMP-7

Abstract

In recent years the search for strategies that improve the healing process in bones are increasing. This happens because most of strategies used today to treat bone are either limited in availability or are rejected by the immune system. So, the use of growth factors, such as bone morphogenic proteins (BMP), attached to scaffolds provides a unique solution since they are not rejected by the immune system and can be produced, which makes them accessible. Growth factors are capable of promoting osteogenesis by recruiting MSC and differentiating them so, when released from the scaffolds, these molecules can accelerate the differentiation of mesenchymal stem cells and, consequently, enhance the healing process. In order to achieve this, this project aimed to test several peptides from the BMP-7 to see if they either enhance or diminished the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. The peptides were then immersed in osteogenic induction medium (OIM) and stem cell medium (SCM). Then, during 21 days, the mixtures, along with a positive control (only OIM) and a negative control (only SCM), were added to the bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) collected from 9 different donors. At days 7, 14 and 21 it was performed both Alizarin Red staining and Real Time RT-PCR, and, in days 2, 7, 14, 19 and 21 it was also done alkaline phosphatase assay. These tests aimed to evaluate the osteogenic differentiation of the BM-MSC in each condition. The overall results are inconclusive, mostly because of donor variability and the low number of donors tested. This is the case of the results from the peptides immersed in SCM which were only tested in one donor, and, therefore, it is impossible to withdraw any decisive conclusion. Nevertheless, there is a peptide that could potentially increase the differentiation of mesenchymal stem cells, when mixed with OIM – BMP- 7 pro domain fragment 1-155 aa, - as it increased the expression of some osteogenic markers and influenced the deposition of calcium deposits in half of the donors tested. However, these results are not statistically significant, as it necessary to perform further experiment with more donors and with different concentrations to confirm this potencial.

Em recentes anos a procura por estratégias que melhoram o processo de cicatrização dos ossos tem vindo a aumentar. Isto acontece porque a maioria das estratégias usadas atualmente para tratar ossos estão limitadas quer pela disponibilidade quer pela rejeição pelo sistema imunitário. Assim, o uso de fatores de crescimento, como as proteínas morfogénicas dos ossos (BMP), acopladas a scaffolds providencia uma solução única, uma vez que estes complexos não são rejeitados pelo sistema imunitário e podem ser produzidos, que os torna acessíveis. Os fatores de crescimento são capazes de promover a osteogénese através do recrutamento e diferenciação de células mesenquimais. Deste modo, quando são libertadas dos scaffolds, estas moléculas conseguem acelerar a diferenciação das células mesenquimais e, consequentemente, melhorar o processo de cicatrização. Para tal, este projeto destinavase a testar vários péptidos do BMP-7 de modo a verificar se estes aumentavam ou diminuíam a diferenciação de células estaminais mesenquimais da medula óssea (BMMSC). Os péptidos foram então imersos em meio de indução óssea (OIM) e meio de cultura de células estaminais (SCM). Depois, durante 21 dias, as misturas, assim como o controlo positivo (apenas OIM) e o controlo negativo (apenas SCM), foram adicionados a BM-MSC de 9 dadores diferentes. Aos dias 7, 14 e 21 foram executados o Alizarin Red staining e o Real Time RT-PCR, e, aos dias 2, 7, 14, 19 e 21 foi também feito análise da phosphatase alcalina. Estes testes tinham como objetivo avaliar a diferenciação osteogénica das BM-MSC em cada condição. No geral os resultados obtidos são inconclusivos, principalmente devido a variabilidade de resposta de dador para dador e ao número reduzido de dadores testados. Este é o caso dos resultados dos péptidos imersos em SCM, que foram testados em apenas um dador, e, deste modo, é impossível retirar alguma conclusão. No entanto, existe um péptido que potencialmente poderá aumentar a diferenciação de MSC quando misturado com OIM – fragmento 1-155 aa do BMP-7 pro domain, - já que este aumentou a expressão de alguns marcadores osteogénicos e a deposição de cálcio em metade dos dadores testados. No entato, estes resultados não são estatisticamente significativos, pelo que é necessário executar mais experiencias com mais dadores e com diferentes concentrações para confirmar tal potencialidade.