Natural origin polymer-based multilayers as a tool for tissue engineering strategies

Abstract

In tissue engineering (TE) and regenerative medicine, a key aspect, that may compromise the therapeutic efficacy of the hybrid device, is an adequate interface between the implant and the surrounding environment. In this thesis, layer-by-layer (LbL) methodology was used to modify surfaces, and to prepare biomaterials solely based on polyelectrolytes multilayers (PEMs), such as membranes and hollow tubular structures. The possibility to functionalizing or engineering TE constructs combined with the ability to incorporate a wide range of building blocks, turns LbL a technique with high potential in the biomedical area. Herein, natural origin polymers (i.e., chitosan – CHI and alginate – ALG) were used to produce different structures through LbL processes, mainly driven by electrostatic interactions. The use of PEMs containing biopolymers are particularly appealing to coat and develop multilayered structures with biochemical functionalities, biocompatibility, and to mimic the interactions observed in native extracellular matrix (ECM). CHI/ALG multilayers were used throughout the thesis, revealing some unique properties, when compared with other polysaccharide multilayers, such as their pH responsiveness and stability within a pH range from 3- 9. The pH responsiveness of this multilayers suggest its potential for several applications, namely for drug delivery. However, natural origin polymer-based multilayers present low stiffness and higher hydration rates, which hinder cell adhesion. To avoid these drawbacks, the multilayers were cross-linked with genipin. Genipin is also a natural product extracted from gardenia fruits that present the ability to improve the mechanical properties, while preserving the pH responsiveness and the stability of the multilayer beyond the pH range 3-9. This thesis also presents the ability to control in space the cross-linking process by developing substrates with a gradient in cross-linking density through a perfect control along the mm/cm length scale.Tailoring the multilayers properties is one of uniqueness abilities of LbL that can be implemented during their assembly or post-assembly. In this context, cross-linking strategies were used in this thesis. Upon adjusting cross-linking parameters (e.g., cross-linker concentration and reaction time) the morphology, thickness, swelling, wettability, diffusion of molecules and mechanical properties can be tuned. Studies of the diffusion of model molecules, such as oxygen and glucose, on these multilayered films, with and without cross-linking presented promising results regarding their use in biomedical applications. The mechanical properties of the multilayers can be further improved combining covalent and ionic crosslinking, which gives rise to a full interpenetrating polymer network. Besides the improvement in the mechanical strength, this approach led to freestanding membranes with multiple interesting properties, such as improved mechanical strength, calcium-induced adhesion and shape memory ability. More interesting it was possible to reversible switches all of these properties, by using a calcium chelating agent solution. The biological performance of CHI/ALG multilayers upon cross-linking reveals that the reaction time and concentration of genipin influence the cell behaviour, namely the adhesion, spreading, and proliferation. Another strategy to enhance cell interactions within multilayers is the immobilization of ECM proteins. Using this approach, cell adhesion increases due to their engagement with specific cell receptors. Combining this strategy with cross-linking, it was possible to recreate the complex environment of blood vessels by co-culturing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human aortic smooth muscle cells (HASMCs) in multilayered hollow tubular structures. These hollow tubular structures were simply obtaining combining LbL with template leaching. The developed work in this thesis shows that LbL is a versatile technique that provides the means to develop a wide array of systems useful in biomedical applications.

Em engenharia de tecidos (TE, do inglês tissue engineering) e medicina regenerativa, um aspeto fundamental, que pode comprometer a eficácia terapêutica do dispositivo hibrido, é ter uma interface adequada entre o implante e o ambiente que o rodeia. Nesta tese, camada-por-camada (LbL, do inglês layer-by-layer) foi usada para modificar superfícies e para preparar biomateriais unicamente baseados em multicamadas de polielectrólitos, tais como: membranas e estruturas tubulares ocas. A possibilidade de funcionalizar ou construir materiais em engenharia tecidos combinada com a capacidade de incorporar uma grande variedade de blocos de construção torna LbL uma técnica com elevado potencial na área biomédica. Nesta tese, polímeros de origem natural (quitosano (CHI, do inglês chitosan) e alginato (ALG, do inglês alginate)) foram usados para produzir diferentes estruturas através da metodologia de LbL baseada em interações electroestáticas. O uso de multicamadas de polielectrólitos contendo biopolímeros é particularmente interessante para revestir e desenvolver estruturas com funcionalidades bioquímicas, biocompatibilidade e para mimetizar as interações observadas na matriz extracelular (ECM, do inglês extracelular matrix). As multicamadas de CHI/ALG usadas ao longo desta tese revelam algumas propriedades únicas quando comparadas com outras multicamadas de polissacarídeos, tais como: a sua capacidade de resposta ao pH, estabilidade dentro de uma gama de pH de 3-9. A capacidade de resposta ao pH destas multicamadas sugere o seu potencial uso para diversas aplicações, nomeadamente para libertação de agentes ativos. Contudo, multicamadas baseadas em polímeros naturais possuem baixa rigidez e altas taxas de hidratação, o que impede a adesão celular. Para contornar estes inconvenientes, as multicamadas foram reticuladas com genipina. Genipina é um produto natural extraído de frutos da gardênia, que apresenta a capacidade de melhorar as propriedades mecânicas, preservando ao mesmo tempo a capacidade de resposta ao pH, bem como a estabilidade das multicamadas para além da gama de pH 3-9. Nesta tese é também apresentada, a capacidade de controlar no espaço o processo de reticulação, através do desenvolvimento de substratos com gradientes de densidade de reticulação por meio de um controlo perfeito ao longo da escala de comprimento mm/cm. O ajuste das propriedades das multicamadas é uma das singularidades do LbL que pode ser implementada durante ou após a construção das multicamadas. Neste contexto estratégias de reticulação foram utilizadas nesta tese. Após o ajuste de parâmetros da reticulação (por exemplo, concentração de reticulante e tempo de reação) a morfologia, a espessura, o inchaço (do inglês swelling), a molhabilidade, a difusão de moléculas e as propriedades mecânicas podem ser ajustadas. Estudos de difusão de moléculas modelo, tais como o oxigénio e glucose, nestes filmes com multicamadas, com e sem reticulação, apresentam um resultado promissor, visando a sua utilização em aplicações biomédicas. As propriedades mecânicas das multicamadas podem ser melhoradas combinando a reticulação covalente com a iónica, dando origem a uma rede interpenetrante completa. Além da melhoria na resistência mecânica, esta abordagem permite obter membranas livres de suporte (do inglês freestanding membranes) com várias propriedades interessantes, como a melhoria da resistência mecânica, adesão induzida por cálcio e capacidade de memória de forma. Curiosamente, todas estas propriedades podem ser revertidas, após simples imersão numa solução quelante de cálcio. O desempenho biológico de multicamadas CHI/ALG mediante a reticulação revela que o tempo de reação e concentração de genipina influencia o comportamento celular, isto é, a adesão, área e proliferação das células. Outra estratégia para aumentar as interações das células dentro de multicamadas é a imobilização de proteínas da matriz extracelular. Usando essa abordagem, a adesão celular aumenta devido ao seu envolvimento com recetores celulares específicos. Combinando esta estratégia com a reticulação, foi possível recriar o ambiente complexo de vasos sanguíneos através da co-cultura de células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVECs, do inglês human umbilical endotelial cells) endoteliais e células do músculo liso da aorta humana (HASMCs do inglês human aortic smooth muscle cells) em estruturas tubulares ocas de multicamadas. Estas estruturas tubulares ocas foram simplesmente obtidas combinando LbL com lixiviação do molde. O trabalho desenvolvido nesta tese demonstra que a técnica de modificação LbL é uma técnica versátil capaz de fornecer meios para desenvolver uma ampla gama de sistemas úteis em aplicações biomédicas.