Mussel adhesive-inspired surface modification to design bi-functional antibacterial coatings

Abstract

Even though the introduction of biomaterials in modern medicine has been crucial in restoring body function and quality of life, all biomaterials are prone to be colonised by microorganisms, representing, therefore, niches for infection in vivo. These biomaterial-associated infections (BAI) are often associated to the biofilm mode of growth, in which bacteria encase themselves in a selfproduced hydrated matrix of extracellular polymeric substances (EPS), conferring them protection against the host immune system and antibiotic treatment. Since bacterial adhesion to the surface of a biomaterial is a crucial step in BAI pathogenesis, surface modification of biomaterials to impart them with the ability to resist bacterial colonisation represents the most potential approach to fight these infections. Considerable advances in the field of antibacterial coatings have been occurred, but few biomaterials have been designed that effectively reduce the incidence of BAI. Therefore, the key goal of this thesis was to propose an effective coating strategy to impart biomaterials with the ability to prevent bacterial adhesion and simultaneously kill the adherent ones, with low propensity for developing bacterial resistance and with absence of adverse effects on the interaction with mammalian cells. Antimicrobial peptides (AMP) and enzymes targeting different EPS were the compounds chosen as antimicrobials alternatives to be immobilized onto biomaterial surfaces. Compounds immobilization was performed using a facile mussel-inspired adhesive coating strategy in which materials were immersed in a solution containing dopamine and the compounds together (1-step approach immobilization), or materials were immersed in an alkaline solution of dopamine to form a thin layer of polydopamine (pDA) and then transferred into a solution containing the AMP and/or enzymes (2-step approach immobilization). Mono and bi-functional coatings were physically characterized in what concerns their morphology, wettability, surface composition and roughness. Scanning electron microscopy and atomic force microscopy showed that the presence of pDA increased the surface roughness of both polydimethylsiloxane (PDMS) and polycarbonate materials, while the measuring of water contact angles showed a decrease on the hydrophobicity characteristic of these materials. Further functionalization with AMP or enzymes yielded surfaces with similar morphology or a more homogeneous coating, when a 2-step or 1-step approach immobilization was performed, respectively. Their antimicrobial and anti-adhesive performance as well their cytotoxicity were also evaluated. A screening with several AMP more traditional and natural such as polymyxins B and E, as well as analogues peptides more active and stable such as Palm and Camel was performed. AMP proved to be good alternatives to antibiotics as they were able to compromise biofilm formation at similar range concentrations to inhibit planktonic growth. Polymyxins B and E were more effective against Pseudomonas aeruginosa while Camel and Palm were more promising against Staphylococcus aureus. Polymyxin E potential was further demonstrated after its physical adsorption onto polystyrene surfaces as it proved to impair biofilm formation and increase P. aeruginosa biofilms susceptibility to antimicrobial treatment. Peptides immobilization was afterwards optimized using the pDA-based approaches. Immobilization of polymyxins B and E onto PDMS rendered the surfaces with antimicrobial activity towards the Gram-negative bacteria P. aeruginosa and showed great potential to overcome some concerns associated to bacterial resistance and toxicity reported in the past for these compounds when in solution. Palm was, however, the AMP chosen to design bi-functional coatings as its immobilization rendered PDMS with effective antimicrobial activity against both Gram-negative and Gram-positive bacteria, especially against the Gram-positive ones, the most commonly found associated to BAI. The immobilization of different enzymes (alginate lyase, lysozyme, proteinase K and DNase I) was afterwards optimized and results showed that catechol chemistry allowed their grafting without compromising their catalytic activity. DNase I was the enzyme chosen for further investigations because exhibited the best anti-adhesive features against a wider spectrum of bacterial strains. Once established the AMP and enzyme with most promising features, their co-immobilization was optimized in order to impart PDMS surfaces with potent antimicrobial and anti-adhesive properties against the adhesion of several strains of P. aeruginosa, S. aureus and Staphylococcus epidermidis as single and dual-species, with excellent stability and no cytotoxicity. To better discriminate co-adhesion of both species on modified surfaces, PNA FISH (Fluorescence in situ hybridization using peptide nucleic acid probes) was also employed, and results showed that P. aeruginosa was the dominant organism, with S. aureus adhering afterwards on P. aeruginosa agglomerates. The fate of bacteria that managed to adhere to the proposed bi-functional coatings was also investigated and results showed that bacteria were more susceptible to antibiotic treatment and to macrophages phagocytosis, without developing bacterial resistance towards the immobilized AMP. In conclusion, a facile and non-toxic mussel-inspired adhesive coating strategy was applied to coimmobilize Palm and DNase I onto biomaterial surfaces without compromise their activity and rendering the surfaces with good antimicrobial, anti-adhesive and anti-biofilm features together with no cytotoxicity and no propensity for developing bacterial resistance. This coating strategy holds, therefore, great potential to be further explored in the design of biomaterial implants and devices to combat BAI.

Ainda que a introdução de biomateriais na medicina atual tenha sido fundamental para recuperar funções do corpo humano comprometidas e melhorar a qualidade de vida em geral, todos eles são propensos a ser colonizados por microrganismos, constituindo, desta forma, nichos para infeção in vivo. As infeções associadas a biomateriais (BAI) estão frequentemente associadas a biofilmes, estruturas biológicas nas quais as bactérias se envolvem numa matriz hidratada de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) por elas produzida, que lhes confere proteção contra o sistema imunitário do hospedeiro e tratamentos com antibióticos. Uma vez que a adesão bacteriana à superfície de um biomaterial desempenha um papel crucial na patogénese de BAI, a modificação de superfícies para as dotar de capacidade de resistir à colonização bacteriana representa a abordagem mais promissora para combater estas infeções. Nos últimos anos tem-se assistido a grandes avanços na área dos revestimentos antibacterianos, contudo, são ainda poucos os biomateriais concebidos que efetivamente reduzem a incidência de BAI. A presente tese teve como objetivo principal propor uma estratégia de revestimento capaz de eficazmente dotar os biomateriais com características de prevenção da adesão bacteriana e, simultaneamente, com capacidade para matar bactérias que eventualmente consigam aderir, e sem potencial para desenvolver resistência bacteriana ou citotoxicidade. Os compostos selecionados como alternativos aos antibióticos para serem imobilizados em biomateriais foram péptidos antimicrobianos (AMP) e enzimas que atuam em diferentes EPS. A imobilização dos compostos foi efetuada recorrendo a uma estratégia de adesão inspirada em mexilhões, seguindo duas abordagens: numa, os materiais foram colocados numa solução contendo simultaneamente dopamina e os compostos a imobilizar (abordagem de imobilização num passo); noutra, os materiais foram incubados primeiramente numa solução alcalina de dopamina, para formar um filme fino de polidopamina (pDA), e depois transferidos para uma solução contendo AMP e/ou enzimas (abordagem de imobilização em 2 passos). Os revestimentos mono e bi-funcionais foram caracterizados fisicamente no que diz respeito à sua morfologia, molhabilidade, composição atómica da superfície e rugosidade. A microscopia eletrónica de varrimento e microscopia de força atómica demonstraram que a presença de pDA aumentou a rugosidade da superfície do polidimetilsiloxano (PDMS) e do policarbonato, enquanto a medição dos ângulos de contacto da água demonstrou uma diminuição da hidrofobicidade característica destes materiais. A funcionalização posterior com AMP ou enzimas gerou superfícies com morfologia semelhante ou com um revestimento mais homogéneo mediante a realização de uma abordagem de imobilização em 2 ou num passo, respetivamente. Os materiais funcionalizados foram também avaliados em termos do seu desempenho antibacteriano e citotoxicidade. Um primeiro estudo para averiguar o potencial antimicrobiano de uma série de AMP mais tradicionais e naturais como as polimixinas B e E, bem como péptidos análogos mais estáveis e potentes, como o Palm e Camel, demonstrou que estes constituem uma alternativa aos antibióticos uma vez que foram capazes de comprometer a formação de biofilme quando utilizados em concentrações semelhantes às necessárias para inibir o crescimento planctónico. As polimixinas B e E foram mais eficazes contra Pseudomonas aeruginosa enquanto o Camel e o Palm foram mais promissores contra Staphylococcus aureus. O potencial da polimixina E foi, ainda, demonstrada após a sua adsorção física em superfícies de polistireno, ao comprometer a formação de biofilme de P. aeruginosa e ainda promover a sua suscetibilidade a tratamentos antimicrobianos posteriores. A imobilização dos AMP foi posteriormente otimizada usando estratégias baseadas na pDA. A imobilização de polimixinas B e E em PDMS conferiu a esta superfície atividade antimicrobiana contra a bactéria Gram-negativa P. aeruginosa e evidenciou o carácter promissor da sua utilização, uma vez que foram superados problemas relacionados com o desenvolvimento de resistência e toxicidade associados a estes AMP quando usados em solução. Palm foi, contudo, o AMP selecionada para manufaturar os revestimentos bi-funcionais dado que a sua imobilização conferiu ao PDMS atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, sendo mais relevante contra as Gram-positivas, as mais frequentemente associadas a BAI. A imobilização de várias enzimas (alginato liase, lisozima, proteinase K e Dnase I) foi também otimizada, tendo-se demonstrado que a imobilização baseada na pDA não comprometeu a sua atividade catalítica. A DNase I foi a enzima que exibiu melhores propriedades anti-adesivas contra um espectro mais alargado de estirpes bacterianas, tendo por isso sido selecionada para a investigação de revestimentos bi-funcionais. Uma vez estabelecido o AMP e a enzima com as caraterísticas mais promissoras, otimizou-se a sua co-imobilização de modo a conferir às superfícies de PDMS atividades antimicrobianas, anti-adesivas e anti-biofilme contra a adesão de várias estirpes de P. aeruginosa, S. aureus and Staphylococcus epidermidis, de forma isolada ou em consórcios de duas espécies, com excelente estabilidade e sem citotoxicidade. A hibridação fluorescente in situ combinada com moléculas de ácido péptido-nucléico (PNA FISH) foi ainda utilizada para a discriminação dos microorganismos nos consórcios polimicrobianos. Foi possível observar que a P. aeruginosa foi o organismo dominante no cosnsórcio, com S. aureus a aderir aos aglomerados de P. aeruginosa. A suscetibilidade das bactérias que eventualmente consigam aderir aos revestimentos propostos foi também investigada tendo-se mostrado que estas bactérias foram mais sensíveis ao tratamento com antibióticos e à fagocitose levada a cabo por macrófagos, sem desenvolverem resistência bacteriana em relação ao AMP imobilizado. Em conclusão, a estratégia de adesão inspirada em mexilhões aplicada para, de forma simples e não-tóxica, co-imobilizar um AMP e uma enzima em biomateriais não comprometeu a sua atividade e dotou as superfícies de PDMS com propriedades antibacterianas relevantes e sem indícios de desenvolvimento de citotoxicidade e de resistência bacteriana. Estes revestimentos apresentam um grande potencial para o desenvolvimento de biomateriais capazes de resistir efetivamente a BAI.