Synthetic biology approaches to shape bacteriophages towards Pseudomonas aeruginosa biofilm control

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is a relevant opportunistic pathogen frequently involved in healthcareassociated infections including pneumonia, bloodstream, urinary tract and surgical site infections. Most of the infections caused by this bacterium are particularly difficult to treat, especially due to its great capacity to form biofilms in a wide variety of surfaces, which often display high tolerance to antibiotics. As a result, it is extremely important to develop new antimicrobial therapies as alternative to the traditional antibiotics. Bacteriophages (phages) are bacterial viruses that have emerged as a potential strategy to combat bacterial infections. Nonetheless, the effectiveness of phages against biofilms can be compromised by diffusion limitations through the biofilm matrix. The recent advances on phage engineering technologies have enabled the creation of specialized phages with new functionalities. The aim of this work was to get a deeper knowledge on phage-P. aeruginosa biofilm interaction and to develop genetically engineered phages with better performances against biofilms. The first step of this work was to isolate and characterize new P. aeruginosa phages. Phage vB_PaeM_CEB_DP1 was isolated from hospital sewage and its characterization was performed together with the previously isolated P. aeruginosa phage, phiIBB-PAA2. Both phages vB_PaeM_CEB_DP1 and phiIBB-PAA2 displayed a broad lytic spectrum, infecting approximately 57% and 86% of thirty P. aeruginosa clinical strains, respectively. The morphological and genomic characterization of both phages revealed that phage vB_PaeM_CEB_DP1 belongs to the Myoviridae family of phages while phage phiIBB-PAA2 belongs to the Podoviridae family. The efficacy of phages vB_PaeM_CEB_DP1, phiIBB-PAA2 as well as the Podoviridae phage LUZ19 against P. aeruginosa biofilms and planktonic cultures was further evaluated, either individually or in a cocktail. The experiments were conducted over the course of 48 hours and, although significant reductions in the number of viable cells were achieved in all treatments, the emergence of phage-resistant variants was observed in both biofilms and planktonic cells infection experiments. Some of the phage-resistant variants were selected for further characterization and the variant strains that displayed resistance to the three phages showed decreased motilities. The genomic characterization of phage-resistant variants revealed that these strains carry mutations in the genes encoding phage receptors. A bioinformatics study about phage-encoded depolymerases was performed to get a deeper knowledge about the diversity, structure and function of these enzymes. In this study 160 putative depolymerases were found in the genomes of 143 phages (43 Myoviridae, 47 Siphoviridae, 37 Podoviridae and 16 unclassified) infecting 24 genera of bacteria, and it was further observed that the majority of them are phage structural proteins. Phage depolymerases revealed to have a wide range of applications. For instance, these enzymes can be used in the production of compounds of interest, to act as antibiotics adjuvants, to cause biofilm eradication as well as for bacterial detection and diagnosis. Finally, phage-engineering strategies were addressed to incorporate genes encoding the biofilm degrading enzymes dispersin B and alginate lyase in the genomes of P. aeruginosa phages. Nonetheless, some problems arise during this part of the work. Although the genomes of phages LUZ19 and vB_PaeM_CEB_DP1 were captured, engineered and archived in yeast, no engineered phages have been obtained so far. In conclusion this work contributed to expand the knowledge about P. aeruginosa phages, strategies used by bacterial cells to evade phage predation, the structure and function of phageencoded depolymerases as well as the phage-engineering technologies currently used.

Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo patogénico oportunista frequentemente envolvido em infeções associadas aos cuidados de saúde, incluindo pneumonia, infeções da corrente sanguínea, do trato urinário, e do local cirúrgico. A maioria das infeções provocadas por esta bactéria são particularmente difíceis de tratar, nomeadamente devido à sua grande capacidade de formar biofilmes em diversas superfícies, os quais têm frequentemente uma grande tolerância a antibióticos. Como consequência, é de extrema importância o desenvolvimento de novas terapias antimicrobianas como alternativa aos tradicionais antibióticos. Os bacteriófagos (fagos) são vírus bacterianos que têm emergido como uma potencial estratégia no combate de infeções bacterianas. No entanto, a eficácia dos fagos em biofilmes pode ser comprometida por limitações de difusão através da matriz dos biofilmes. Os recentes avanços nas tecnologias de engenharia de fagos têm permitido a construção de fagos especializados com novas funções. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi compreender melhor a interação entre fagos e biofilmes de P. aeruginosa e desenvolver fagos geneticamente modificados de forma a terem uma melhor performance em biofilmes. O primeiro passo deste trabalho consistiu no isolamento e caracterização de novos fagos para P. aeruginosa. O fago vB_PaeM_CEB_DP1 foi isolado de efluente hospitalar, e a sua caracterização foi realizada juntamente com o fago de P. aruginosa phiIBB-PAA2 que foi previamente isolado. Ambos os fagos vB_PaeM_CEB_DP1 e phiIBB-PAA2 apresentaram um amplo espectro lítico, infectando aproximadamente 57% e 86% de trinta estirpes clinicas de P. aeruginosa, respetivamente. A caracterização morfológica e genómica de ambos os fagos revelou que o fago vB_PaeM_CEB_DP1 pertence à família de fagos Myoviridae enquanto que o fago phiIBB-PAA2 pertence à família Podoviridae. A eficácia dos fagos vB_PaeM_CEB_DP1, phiIBB-PAA2, assim como do fago Podoviridae LUZ19 contra biofilmes e culturas planctónicas de P. aeruginosa foi avaliada, tanto individualmente como em cocktail. Os ensaios experimentais foram realizados durante 48 horas e, apesar de se terem conseguido reduções significativas no número de células viáveis com todos os tratamentos, a emergência de variantes resistentes aos fagos foi observada tanto nos ensaios de infeção de biofilmes como de culturas planctónicas. Algumas das variantes resistentes aos fagos foram selecionadas para caracterização e observou-se que as variantes resistentes aos três fagos apresentaram motilidades reduzidas. A caracterização genómica destas variantes revelou que estas estirpes possuem mutações nos genes que codificam os receptores dos fagos. Para aprofundar o conhecimento sobre a diversidade, estrutura e função das depolimerases codificadas por fagos, foi realizado um estudo bioinformático sobre estas enzimas. Neste estudo foram encontradas 160 depolimerases putativas nos genomas de 143 fagos (43 Myoviridae, 47 Siphoviridae, 37 Podoviridae e 16 não classificados) que infetam 24 géneros de bactérias, e foi ainda observado que a maioria delas são proteínas estruturais dos fagos. As depolimerases fágicas revelaram ter uma grande variedade de aplicações. Estas enzimas podem, por exemplo, ser utilizadas na produção de compostos de interesse, podem atuar como auxiliares de antibióticos, podem ajudar na erradicação de biofilmes e também na detecção e diagnóstico de bactérias. Finalmente, foram abordadas estratégias de engenharia de fagos para incorporar genes que codificam as enzimas que degradam biofilmes, dispersina B e alginato liase, nos genomas de fagos de P. aeruginosa. No entanto, alguns problemas surgiram nesta parte do trabalho. Apesar dos genomas dos fagos LUZ19 e vB_PaeM_CEB_DP1 serem capturados, modificados e arquivados em levedura, até ao momento não foram obtidos fagos modificados. Em conclusão, este trabalho contribuiu para alargar o conhecimento sobre fagos de P. aeruginosa, as estratégias usadas pelas células bacterianas para escapar à predação dos fagos, a estrutura e função das depolimerases codificadas por fagos, assim como as tecnologias de modificação de fagos usadas atualmente.