HOXA9 as a key regulator in glioma initiation, aggressiveness and response to therapy

Abstract

Glioblastoma (GBM) is the most common malignant tumor type of the central nervous system. The clinical outcome is particularly poor, with a median survival of approximately 15 months after diagnosis. Despite GBM being extremely heterogeneous, patients are equally treated with a standardized therapeutic approach, consisting of surgery followed by radiation and chemotherapy with temozolomide (TMZ). There are increasing evidences on the prognostic and therapeutic relevance of the developmental transcription factors HOX proteins, particularly HOXA9, in GBM. Recent studies described the aberrant overexpression of HOXA9 as a novel, independent negative prognostic factor in GBM patients. Additionally, HOX genes were identified as part of a glioma stem cell gene expression signature, with prognostic value in GBM patients treated with TMZ-based chemo-radiotherapy. However, a more comprehensive understanding of the molecular downstreamtargets and the functional consequences of HOXA9 activation on the establishment and maintenance of the malignant phenotype of glioblastoma was required. In this context, the research summarized along this thesis focuses on the mechanisms by which HOXA9 influences GBM's aggressiveness and prognosis, with a particular attention on its relationship with resistance to TMZ. While doing so, the roles of HOXA9 and its target genes in critical hallmarks of GBM are also addressed. The transcriptome of HOXA9 was investigated by whole-genome gene expression microarrays performed in GBM cell models, including long-term established and freshly-derived primary GBM cell lines. Biologic process clustering analyses revealed that HOXA9-target genes have key roles in cancer, including genes involved in cell adhesion, migration, cell cycle and DNA repair. Additionally, gene set enrichment analysis showed the HOXA9-transcriptome is reminiscent of “selfrenewal” stem cell signatures. Using in vitro assays, it was observed that HOXA9 expression decreases cell death, and increases the stemness capacity, cell viability, invasion, and resistance of GBM cells to TMZ treatment. Importantly, in vivo GBM xenograft subcutaneous and orthotopic models validated the HOXA9-mediated functions and increased resistance to TMZ. Mechanistically, HOXA9 increased the expression of BCL2 protein, an important anti-apoptotic protein, and reduced the expression of several mismatch-repair, which together dictate increased resistance to TMZ. Critically, the high resistance to TMZ was significantly reverted in HOXA9-positive GBM cells by combinatorial pharmacological treatments with a BCL2 specific inhibitor, suggesting that this combination of drugs may be further explored in clinical settings. Having identified several cellular and molecular mechanisms by which HOXA9 influences a multitude of critical hallmarks of GBM, including the oncogenic role of HOXA9 transforming nontumorigenic immortalized astrocytes into tumorigenic cells, it was then explored in detail the functional and clinical relevance of CDH3 gene (encoding P-cadherin), one of the identified downstream targets of HOXA9, for which nothing has been described in the context of gliomas. CDH3 was previously described as a direct target of HOXA9 in epithelial ovarian cancer, and has known roles in cell adhesion, invasion and migration. Here, it was found that the expression of HOXA9 was associated with CDH3 expression. These results suggested that HOXA9 regulates CDH3 and, consequently, HOXA9 could exert part of its functional effects via P-cadherin in GBM. Pcadherin was identified as important player in critical functional roles in GBM, affecting stemness, cell viability, migration and cell adhesion in vitro. Importantly, these findings were further supported by in vivo subcutaneous models, in which P-cadherin was associated with higher tumor volumes. Testing a small set of human glioma samples, it was found preliminary evidences that P-cadherin is associated with higher grades of gliomas, and its expression is higher in recurrence lesions and areas of neovascularization. Importantly, the results showed that CDH3 may be a novel prognostic biomarker with clinical value for GBM patients. Overall, the work summarized in this thesis significantly contributed to understanding the consequences of HOXA9 activation in GBM, identifying several mechanisms by which this transcription factor influences aggressiveness and poor prognosis in GBM patients. A new relevant HOXA9 downstream target was identified, P-cadherin, whose role was totally unknown in GBM and may have a crucial role in the aggressiveness of these tumors. It was also described the role of HOXA9 in glioma initiation and in resistance to current therapy. These findings may offer new therapeutic opportunities, taking into account the expression HOXA9, which could lead to a new classification of patients into subgroups of non-responsive GBM to TMZ, avoiding side effects and decreasing the direct costs related to current treatment. Moreover, these results warrant further investigation in GBM treatment using anti-apoptotic inhibitors and new therapies based in P-cadherin high expression. Additionally, further investigations are required to clarify the specific contributions of HOXA9 in the origin of this highly lethal tumor.

Os glioblastomas (GBMs) são os tumores cerebrais mais frequentes e malignos do sistema nervoso central. O quadro clínico dos pacientes com GBM é particularmente crítico e imprevisível, apresentando estes uma mediana de sobrevivência baixa, de aproximadamente 15 meses. Contudo, e apesar da natureza heterogénea dos GBM, atualmente estes pacientes dispõem apenas de uma modalidade terapêutica, baseada em cirurgia, combinada com adjuvante radio e quimioterapia com Temozolamida (TMZ). Evidências crescentes, têm colocado as proteínas HOX, particularmente a HOXA9, que são factores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento embrionário, com implicações no prognóstico e terapia destes tumores. Estudos recentes, descreveram que a sobre-expressão do HOXA9 está associada, independentemente de outros factores, com um pior prognóstico em pacientes com GBM. Adicionalmente, os genes HOX foram identificados como sendo parte de uma assinatura de expressão genética de células estaminais de glioma, e com valor prognóstico em pacientes com GBM submetidos a um tratamento combinado rádio e quimioterapia com TMZ. Contudo, mais estudos são necessários para uma melhor compreensão das consequências funcionais e dos alvos moleculares a jusante da ativação no HOXA9, no estabelecimento e manutenção do fenótipo maligno em GBM. Por conseguinte, a investigação sumariada ao longo desta tese, teve como principal objetivo averiguar os mecanismos pelos quais a expressão do gene HOXA9 induz agressividade, influência o prognóstico dos pacientes com GBM e a resistência à TMZ. Adicionalmente, o papel desempenhado pelos seus alvos moleculares em características cruciais de GBM foi igualmente abordado. Assim, foi analisado o transcriptoma do HOXA9 em várias linhas celulares de GBM, definitivas e primárias, através de microarrays de expressão genómica. A análise da expressão dos transcritos do HOXA9 revelou que estes se associavam a um conjunto de processos biológicos relacionados com vias oncogénicas, tais como, a adesão celular, a migração, o ciclo celular e a reparação do ADN. Adicionalmente, estes transcritos estavam, também, associados à capacidade de autorrenovação e a características de células estaminais. Estudos com modelos in vitro, após manipulação genética da expressão do HOXA9 em células de GBM, mostraram uma diminuição da morte celular, um aumento da capacidade estaminal, da viabilidade celular, da invasão e da resistência à TMZ. Estudos in vivo, usando modelos murino de xenotransplante, ortotópicos e subcutâneos, demonstraram que a expressão do HOXA9 aumenta a resistência à TMZ. Observou-se, ainda, que os mecanismos pelos quais o HOXA9 leva a esta resistência podem dever-se ao aumento da expressão da proteína BCL2, uma importante proteína anti-apoptótica, e à redução da expressão de várias proteínas da via de reparação de danos de ADN ( “DNA mismatch-repair pathway”). Esta resistência mediada pela expressão da BCL2, foi revertida usando um inibidor específico para esta proteína em combinação com a TMZ, em células HOXA9 positivas. Após a identificação dos mecanismos moleculares e celulares pelos quais a expressão do HOXA9 influencia diversas características dos GBM, incluindo o seu potencial oncogénico, observado pela transformação maligna de astrócitos imortalizados e não-tumorigénicos, foi avaliada detalhadamente a relevância funcional e clínica do gene CDH3 (que codifica a P-caderina), identificado como um alvo do HOXA9 e, do qual nada se sabia em gliomas. O gene CDH3 foi anteriormente descrito como sendo um alvo direto do HOXA9 em cancro epitelial do ovário e com relevância funcional ao nível da adesão celular, invasão e migração. Neste trabalho, foi descrito que a expressão do HOXA9 está associada com a expressão do gene CDH3. Estes resultados sugerem que o HOXA9 regula o gene CDH3 e, consequentemente, o HOXA9 pode exercer parte dos seu efeitos funcionais, em GBM, via P-caderina. Descreveu-se que a P-caderina tem uma relevância funcional em modelos in vitro de GBM, afectando a capacidade estaminal, a viabilidade, a migração e a adesão celular. Adicionalmente, estes resultados foram suportados por resultados in vivo, em modelos subcutâneos de murino, nos quais a expressão de P-caderina levou a um maior volume tumoral. Num pequeno conjunto de gliomas humanos, a elevada expressão da P-caderina foi associada com gliomas de alto grau, recorrência e regiões de neovascularização. Além disso, observou-se que a expressão do gene CDH3 pode ser um novo putativo bio-marcador de prognóstico com valor clínico em pacientes com GBM. Em suma, o trabalho descrito ao longo desta tese, contribuiu significativamente para a compreensão das consequências da ativação do HOXA9 em GBM, identificando-se vários mecanismos pelos quais este induz agressividade e pior prognóstico nos pacientes de GBM. Foi identificado um novo alvo do HOXA9 com relevância em GBM, a P-caderina, que parece induzir agressividade nestes tumores. Foi descrita, ainda, a importância do HOXA9 na iniciação dos gliomas e na resistência à TMZ. Desta forma, estes resultados podem ter fortes implicações nas decisões terapêuticas, podendo conduzir a uma nova classificação de subgrupos de GBM, nãoresponsivos à TMZ, reduzindo, assim, os efeitos secundários e os altos custos associados ao tratamento. Além disso, estes dados devem ser complementados com novas investigações terapêuticas usando quer inibidores anti-apoptóticos, quer novas abordagens terapêuticas tendo por base o novo putativo alvo terapêutico identificado, a P-caderina. Adicionalmente, são necessárias investigações para clarificar a contribuição do HOXA9 na origem destes tumores altamente letais.