Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/40463

TitleProtein-based nanodevices for therapeutic applications
Other titlesNanodispositivos à base de proteína para aplicações terapêuticas
Author(s)Loureiro, Ana Isabel Sá
Advisor(s)Gomes, Andreia
Cavaco-Paulo, Artur
Issue date11-Dec-2015
Abstract(s)The development of nanodevices for clinical use brings new hope for current medicine due to the possibility to improve the efficiency of drug delivery. Many pharmacological compounds present characteristics, such as their quick degradation, water insolubility and significant toxicity, that prevent a simple mode of administration. Therefore, nanodevices are exploited to carry drugs from the site of administration to the therapeutic target site. Although in the last decades several innovative nanodevices have been developed, protein-based nanodevices have raised substantial interest. Albumin is the most abundant plasma protein and is involved in important physiological functions. Moreover, albumin’s availability, biocompatibility, biodegradability, and its lack of toxicity and immunogenicity, are all important factors in nanodevice development. Albumin-based nanoparticles present several advantages as drug carriers: the presence of reactive groups on their surface allows surface modification; a high content of charged amino acids allows the electrostatic adsorption of charged molecules; represent a promising strategy for cancer therapy due to their enhanced uptake in solid tumors mediated by albumin-binding proteins, and due to the hypoalbuminemia commonly observed in cancer patients. The aim of this work is the development of albumin-based nanoparticles as drug delivery systems (DDS), mainly for cancer therapy. High pressure homogenization, a high-energy emulsification method, was explored as it presents several advantages. This work reports the optimization of this method for the production of albumin-based nanoparticles suitable for intravenous administration, here designated nanoemulsions taking into account the production method. After several steps of optimization, stable nanoemulsions of small, defined and controllable size were obtained. The addition of a tri-block copolymer, Poloxamer 407, which presents poly(ethylene glycol) (PEG) chains in its composition, allowed the regulation of nanoparticle size and of its surface characteristics. Molecular dynamic simulation and the fluorescent tagging of the Poloxamer 407 were used to better understand the interactions between the different components of the system and their mechanistic role on the size of nanoparticles. The results demonstrated that the hydrophobic part of Poloxamer 407 interacts preferably with the oil, decreasing hydrophobic interactions between oil and protein, which may be responsible for size reduction. Additionally, it was observed that albumin and Poloxamer 407 interact forming a matrix surrounding the oil. The biological characterization of the nanoemulsions proved that they do not induce cytotoxicity nor oxidative stress in normal human cells. Folic acid (FA)-tagged nanoemulsions were produced and were shown to achieve specific folate receptor (FR)-mediated targeting in FR positive cells. The entrapment of different pharmacological drugs in nanoemulsions was also tested and successful incorporation, mainly of hydrophobic compounds, was observed. As the addition of Poloxamer 407 also affects nanoemulsions’ surface characteristics, the stealth degree was studied in the presence of different concentrations of this PEGylated surfactant. The internalization of the PEGylated nanoparticles by activated macrophages was assessed and the results demonstrated that nanoparticles containing the highest concentration of surfactant (5 mg/mL) were less phagocytosed. Thus, this formulation can generate stealth nanoemulsions with improved blood circulation time and biodistribution. Functionalized albumin nanoemulsions were produced through the incorporation of chemically modified albumin in the initial formulation for nanoemulsion production. Albumin-drug/targeting agent conjugates were developed using different coupling methods. The functionalized nanoemulsions efficiently delivered drugs and mediated specific cell targeting in vitro. The nanoemulsions suitable characteristics, small size and PEGylated surface, may help overcome problems associated with free drugs therapies, improving their therapeutic efficiency. FA-tagged albumin nanoemulsions were loaded with carbon monoxide releasing molecule-2 (CORM-2), a hydrophobic compound that present anti-proliferative capacity against cancer cells. The biological effects of these nanoemulsions were tested both in vitro and in vivo. The results showed the selective delivery of CORM-2 into A20 B-cell lymphoma cells (FR positive cells). Their therapeutic efficacy was also observed in BALB/c mice bearing subcutaneous A20 lymphoma tumors through considerable tumor growth inhibition as well as a substantial increase of mice survival. These albumin-based nanoemulsions were well tolerated by the immunocompetent mice. In summary, albumin-based nanoparticles developed in this work evidenced that this type of nanodevices can be successfully used as DDS for a wide range of therapeutic applications, with an immense potential for cancer therapy application.
O desenvolvimento de nanodispositivos para uso clínico é uma área promissora para a medicina devido à possibilidade de melhorar a eficiência da entrega de fármacos. Muitos compostos farmacológicos apresentam características que impedem a sua administração simples, tais como a sua degradação rápida, insolubilidade em solução aquosa e grande toxicidade. Assim, os nanodispositivos são explorados para aplicações terapêuticas pela possibilidade de transportar os fármacos desde o local de administração até ao local de intervenção terapêutica. Embora nas últimas décadas vários nanodispositivos originais tenham sido desenvolvidos, os nanodispositivos à base de proteína têm merecido particular interesse. A albumina é a proteína mais abundante no plasma e está envolvida em funções fisiológicas importantes. Além disso, a sua disponibilidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e ausência de toxicidade e imunogenicidade, são importantes fatores no desenvolvimento de nanodispositivos. As nanopartículas à base de albumina apresentam várias vantagens na veiculação de fármacos: a presença de grupos reativos à superfície permite a sua modificação funcional; um elevado conteúdo em aminoácidos carregados permite a adsorção electroestática de moléculas carregadas; representam uma estratégia promissora para a terapia do cancro devido à sua captação aumentada em tumores sólidos através de proteínas de ligação à albumina, e devido à hipo-albuminemia comumente observada em pacientes oncológicos. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de nanopartículas à base de albumina como sistemas de entrega de droga (DDS), principalmente para a terapia do cancro. Neste sentido, foi explorada a homogeneização de alta pressão, um método de emulsificação de elevada energia, que apresenta várias vantagens. Este trabalho reporta a otimização deste método para a produção de nanopartículas à base de albumina adequadas para administração intravenosa, que foram designadas nanoemulsões tendo em conta o método de produção. Após várias etapas de otimização foram obtidas nanoemulsões estáveis de tamanho pequeno, definido e controlável. A adição de um copolímero tri-bloco, Poloxamer 407, que apresenta cadeias de poli(etilenoglicol) (PEG) na sua composição, permitiu regular o tamanho das nanopartículas e as suas características de superfície. A simulação de dinâmica molecular e a marcação fluorescente do Poloxamer 407 permitiram compreender melhor as interações entre os diferentes componentes do sistema e o seu papel mecanístico no tamanho das nanopartículas. A parte hidrofóbica do Poloxamer 407 interage preferencialmente com o óleo, diminuindo as interações hidrofóbicas entre óleo e proteína, o que poderá ser responsável pela redução de tamanho. Adicionalmente, observou-se que a albumina e o Poloxamer 407 interagem formando uma matriz em torno do óleo. A caracterização biológica das nanoemulsões demonstrou que elas não induzem citotoxicidade nem stress oxidativo em células humanas normais. Foram produzidas nanoemulsões funcionalizadas com ácido fólico (FA) que demonstraram direcionamento específico mediado pelo recetor de folato (FR) em células positivas para este recetor. A incorporação de diferentes fármacos nas nanoemulsões também foi testado sendo particularmente eficiente com compostos hidrofóbicos. Uma vez que a adição de Poloxamer 407 também afeta as características de superfície das nanoemulsões, foi estudado o grau de “stealth” na presença de diferentes concentrações deste surfactante PEGuilado. O estudo da internalização das nanopartículas PEGuiladas por macrófagos ativados demonstrou que as nanopartículas contendo a concentração mais elevada de surfactante (5 mg/mL) foram menos fagocitadas. Assim, esta formulação produz nanoemulsões “stealth” o que poderá prolongar o seu tempo de circulação no sangue e biodistribuição. Foram produzidas nanoemulsões de albumina funcionalizadas através da incorporação de albumina modificada quimicamente na formulação inicial para produção. Os conjugados de albumina-fármaco/agente de direcionamento foram desenvolvidos utilizando diferentes métodos de acoplamento. As nanoemulsões funcionalizadas revelaram eficiência na entrega de fármacos e capacidade de direcionamento específico in vitro. Devido às suas características adequadas, tamanho pequeno e superfície PEGuilada, estas nanoemulsões permitirão ultrapassar os problemas associados com terapias de fármacos livres, melhorando a eficiência terapêutica. Desenvolveram-se também nanoemulsões de albumina contendo FA e um composto hidrofóbico, a molécula libertadora de monóxido de carbono-2 (CORM-2), com atividade anti-proliferativa contra células de cancro. Os efeitos biológicos destas nanoemulsões foram testados in vitro e in vivo. Os resultados demonstraram a entrega seletiva de CORM-2 em células A20, linfoma de células B (células que expressam o FR). A eficácia terapêutica foi também verificada em ratinhos BALB/c portadores de tumores de linfoma subcutâneos pela inibição considerável do crescimento tumoral e aumento substancial da sobrevivência dos ratinhos. Foi também observado que estas nanoemulsões à base de albumina foram bem toleradas por ratinhos imunocompetentes. Em conclusão, as nanoparticulas à base de albumina desenvolvidas neste trabalho evidenciaram que este tipo de nanodispositivos pode ser utilizado com sucesso como DDS para uma ampla gama de aplicações terapêuticas, com um imenso potencial para aplicação na terapia do cancro.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (área de especialização em Biologia Celular e Saúde).
URIhttp://hdl.handle.net/1822/40463
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses
DBio - Teses de Doutoramento/Phd Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Ana Isabel Sá Loureiro.pdf
  Restricted access
9,05 MBAdobe PDFView/Open    Request a copy!

Partilhe no FacebookPartilhe no TwitterPartilhe no DeliciousPartilhe no LinkedInPartilhe no DiggAdicionar ao Google BookmarksPartilhe no MySpacePartilhe no Orkut
Exporte no formato BibTex mendeley Exporte no formato Endnote Adicione ao seu ORCID