Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/40410

TitleImpact of mutated KRAS signalling on autophagy regulation in colorectal carcinoma
Author(s)Alves, Sara Cristina Sequeira
Advisor(s)Almeida, Ana Arminda Lopes Preto de
Sousa, Maria João
Côrte-Real, Manuela
Issue date14-Feb-2014
Abstract(s)Colorectal carcinoma (CRC) is the third most commonly diagnosed cancer worldwide and one of the most abundant causes of cancer related deaths. KRAS mutations ( KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V) are frequent events in CRC, detected in about 30% to 50% of the clinical cases, and seem to play an important role in colon carcinogenesis. It is known that KRAS mutations are predictive biomarkers for resistance of CRC to EGFR inhibitors, though the exact mechanism is poorly understood. Autophagy is a catabolic process evolutionarily conserved from yeast to mammals, used by the cells to maintain cellular homeostasis but deregulated in some cancers, including CRC. It has been implicated in both cancer initiation and progression, playing a pro-survival or a pro-death role, depending on the stage of carcinogenesis and on the type of cancer, and also in the resistance of tumours to chemotherapy. In the case of CRC development, the role of autophagy is controversial and poorly understood. Oncogenic RAS has been implicated in autophagy regulation with different outcomes in cancer progression depending on the cell context. However, little is known about the impact of mutated KRAS in autophagy regulation as well as the signalling pathways implicated in CRC and in normal colon cells, constituting an emerging field of research that needs further clarification. Understanding the role of mutated KRAS signalling in autophagy regulation in colon carcinogenesis may contribute to new perspectives for therapeutic approaches in resistant CRC harbouring KRAS mutations. In the present work, we aimed to investigate the precise contribution of activating KRAS mutations in autophagy regulation in normal and CRC cells, as well as the signalling pathways involved, and how this impacts cell survival. In order to achieve our goal, we established two “clean” cellular models that provide the advantage of studying these mutations in the same genetic background: the normal colonic epithelial cell (NCM460) model and the yeast S. cerevisiae model, where we individually overexpressed the different KRAS mutations ( KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V) as well as the wild-type KRAS ( KRASWT). To complete our studies, we confirmed the results obtained in established patient-derived CRC cell lines: HCT116 and SW480, harbouring a KRASG13D and a KRASG12D mutation, respectively. We showed that expression of KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V up-regulates autophagy to a greater extent than expression of KRASWT in both normal colon NCM460 cells and S. cerevisiae cells facing environmental stress like nutrient limitation. Accordingly, we found that inhibition of KRAS decreases the autophagic flux in CRC-derived cells HCT116 and SW480 under nutrient starvation conditions, decreasing the formation of the Atg5-Atg12 complex, LC3-II delivery to the lysosome and Beclin 1 levels, thus demonstrating that autophagy in these cells is KRAS-dependent. The fact that we obtained similar results regarding the role of KRAS in autophagy using the different cell systems validates our newly established “KRAS-humanized yeast” and normal colon cells stably expressing KRAS mutations as new cell models to study the role of mutated KRAS in colon carcinogenesis. We also identified KRAS signalling effectors involved in autophagy regulation in our cell models. In S. cerevisiae cells, KRAS-induced autophagy occurs via regulation of Tor1p and Sch9p, components of the TOR pathway. In normal NCM460 colon cells, KRAS-induced autophagy proceeds through up-regulation of the MEK/ERK pathway and down-regulation of the PI3K/AKT pathway. In accordance with the results obtained in the NCM460 cell model, suppression of KRAS decreased ERK phosphorylation in HCT116 and SW480 cells, and increased AKT phosphorylation in SW480 cells. Silencing of MEK1/2 and PIK3CA in SW480 cells further demonstrated that KRASinduced autophagy is dependent on up-regulation of the MEK/ERK pathway. Together, these data strongly support the hypothesis that KRAS-induced autophagy in CRC cells is dependent on the activation of the MEK/ERK pathway and inactivation of the PI3K/AKT/mTOR pathway. Our data also show that autophagy contributes to the survival of normal and CRC cells during starvation. We demonstrated that overexpression of KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V increases the proliferative lifespan and survival of normal colon cells during starvation, consistent with the fact that KRAS mutations are important during adenoma progression in colorectal carcinogenesis. We also observed that CRC cells harbouring KRASG13D, PIK3CAH1047R mutations and EGFR overexpression seem to be more sensitive to autophagy inhibition during starvation than CRC cells with only a KRASG12V mutation. We therefore expect that our results might have relevant implications for redefinition of therapeutic approaches of CRC harbouring KRAS, PIK3CA mutations and overexpressing EGFR, which are resistant to EGFR inhibitors, as autophagy inhibitors might overcome the resistance of these CRCs with poor prognosis.
O carcinoma colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais diagnosticado e uma das principais causas de morte relacionadas com cancro. No CCR, as mutações KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V são eventos frequentes, estando presentes em 30% a 50% dos casos clínicos e parecem desempenhar um papel crucial na carcinogénese do cólon. Sabe-se que mutações KRAS oncogénicas são marcadores biológicos preditivos de resistência à terapia do CCR com inibidores do EGFR. A autofagia é um processo catabólico evolutivamente conservado desde as leveduras até aos mamíferos, usado pelas células para manter a homeostasia celular e está desregulado em diversos cancros, incluindo o CCR. Tem sido implicada na iniciação e progressão do cancro, desempenhando um papel promotor de sobrevivência ou morte, dependendo da fase do processo carcinogénico e do tipo de cancro, bem como na resistência dos tumores à quimioterapia. No caso do desenvolvimento do CCR, o papel da autofagia é controverso e não é bem compreendido. O RAS oncogénico tem sido implicado na regulação da autofagia com diferentes respostas na progressão do cancro dependendo do contexto celular. Pouco se sabe sobre o impacto do KRAS mutado na regulação da autofagia, bem como das vias de sinalização implicadas no CCR e em células normais do cólon, sendo por isso uma linha de investigação emergente que necessita de esclarecimento. Compreender o papel da sinalização do KRAS mutado na regulação da autofagia na carcinogénese do cólon pode contribuir para novas abordagens terapêuticas nos CCR resistentes que possuem mutações no KRAS. Neste trabalho, pretendeu-se investigar a contribuição específica das mutações KRAS oncogénicas na regulação da autofagia em células normais e do CCR, bem como das vias de sinalização envolvidas e qual o impacto na sobrevivência celular. De modo a cumprir o nosso objetivo, estabelecemos dois novos modelos celulares “limpos” que têm como vantagem permitir o estudo destas mutações no mesmo “background” genético: o modelo de células epiteliais normais do cólon (NCM460) e o modelo da levedura Saccharomyces cerevisiae, nos quais expressamos individualmente os diferentes mutações do KRAS ( KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V) bem como o KRAS selvagem ( KRASWT). Para completar o nosso estudo, confirmamos os resultados obtidos em linhas celulares estabelecidas derivadas de pacientes com CCR, HCT116 e SW480, contendo as mutações KRASG13D e KRASG12V, respetivamente. Mostramos que a expressão de KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V nas células NCM460 e na levedura S. cerevisiae, quando sujeitas a um ambiente de stresse como privação de nutrientes, regula positivamente a autofagia comparativamente com a expressão de KRASWT. De igual modo, verificamos que a inibição de KRAS diminui o fluxo autofágico nas células derivadas de CCR, HCT116 e SW480, em condições de privação de nutriente, diminuindo a formação do complexo Atg5-Atg12, o transporte de LC3-II para o lisossoma e o nível de proteína Beclin 1, demonstrando que a autofagia é dependente do KRAS. A concordância dos resultados obtidos relativamente ao papel do KRAS na autofagia usando os diferente sistemas celulares valida o uso da recém estabelecida "levedura humanizada para o KRAS” e das células normais do cólon expressando as mutações do KRAS como novos modelos celulares para o estudo do papel do KRAS mutado na carcinogénese do cólon. Efetores da sinalização pelo KRAS envolvidos na regulação da autofagia nos nossos modelos celulares foram igualmente identificados. Nas células de S. cerevisiae, a autofagia induzida pelo KRAS ocorre via Tor1p e Sch9p, componentes da via TOR. Nas células normais do cólon NCM460, a autofagia induzida pelo KRAS ocorre através da regulação positiva da via MEK/ERK e da regulação negativa da via PI3K/AKT. Em concordância, a supressão do KRAS diminuiu a fosforilação das ERK nas células HCT116 e SW480, e aumentou a fosforilação do AKT nas células SW480. A supressão de MEK1/2 e PIK3CA nas células SW480 confirmou mais uma vez que a indução de autofagia pelo KRAS nas células CCR é dependente da ativação da via MEK/ERK. Estes dados apoiam a hipótese de que a autofagia induzida pelo KRAS em células CCR é dependente da ativação da via MEK/ERK e da inativação da via PI3K/AKT/mTOR. Os nossos dados mostram que a autofagia contribui para a sobrevivência das células normais do cólon e das células CCR durante a privação de nutrientes. Demonstramos que a sobreexpressão de KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V aumenta o tempo de vida proliferativo e a sobrevivência de células normais do cólon, o que é consistente com o facto de serem importantes na progressão de adenoma na carcinogénese colorretal. As células de CCR contendo mutações KRASG13D, PIK3CAH1047R e sobreexpressão de EGFR parecerem ser mais sensíveis à inibição de autofagia durante a privação de nutrientes, do que as células CCR apenas com a mutação KRASG12V. Os resultados deste trabalho podem ter implicações relevantes nas abordagens terapêuticas do CCR contendo mutações KRAS, PIK3CA e sobreexpressão do EGFR, que conferem resistência a inibidores do EGFR, visto que inibidores da autofagia podem reverter a resistência destes CCRs de prognóstico reservado.
TypeDoctoral thesis
DescriptionPrograma Doutoral em Biologia Molecular e Ambiental
URIhttp://hdl.handle.net/1822/40410
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
DBio - Teses de Doutoramento/Phd Theses

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