Looking for mechanisms regulating lung growth in CDH: rat and human studies

Abstract

Lung development is a complex process that involves a coordinated orchestration of several signalling pathways and mechanisms in order to growth normally. Pulmonary hypoplasia emerges as a result of foetal abnormal lung development and consequently it leads to high rates of morbidity and mortality. The understanding of normal and abnormal foetal lung growth has became clinical relevant because it can offer new perspectives in the treatment of lung diseases. Regardless the recent advances in the knowledge of lung development, there are still a lot of mechanisms that need to be elucidated and investigated. The main aim of this PhD dissertation was to investigate new physiological regulators of foetal lung growth in order to find a prenatal therapy to revert foetal lung hypoplasia in Congenital Diaphragmatic Hernia (CDH) context. Moreover, two already well-known and studied signalling pathways (retinoic acid and neuroendocrine factors) were further investigated and an important link between them was discovered/established. Using molecular/histological techniques and gain-loss of function studies with nitrofen rat model and human samples we tried to achieve our goals. In this PhD thesis, it was demonstrated that ephrins B1, -B2 and eph B4 receptor were expressed during all foetal lung developmental stages. Moreover ephrin B1 and eph B4 receptor mainly presented mesenchymal expressions whereas ephrin B2 presented an epithelial expression. Ephrin B1 and –B2 administration contributed to increase foetal lung branching, but the observed increase has not significant biological meaning. Another interesting finding was the importance of microRNAs in human CDH. MicroRNA 10a and microRNA 200b are up-regulated in CDH human lungs when compared to normal lungs and they are also changed in the tracheal fluid of CDH babies that respond or did not respond to FETO. In FETO responders, after removing the plug, tracheal fluid presented higher expression of miR-10a and miR-200 family when compared to non-responders. Moreover, in responders the expression of those microRNAs increased significantly after removing the plug when compared to the expression observed at the moment of plug insertion. In line with the second aim mentioned above, we decided to look into two already known and apparently unrelated signalling pathways and discover a link between them because both of them are altered in CDH (retinoic acid was down-regulated and neuroendocrine factors were up-regulated). We found that neuroendocrine factors act as regulators of lung growth, sensitizing the lungs to the action of retinoic acid through RAR α and RAR γ up-regulation. To conclude, in this thesis, we showed that ephrins seem to be strong candidates to act as morphogens or being involved in vascular regulation instead of being a promisor mechanism to regulate lung growth. Additionally, we discovered that microRNAs are an important tool as a prognostic biomarker for CDH new-borns outcome. Moreover, we established a novel physiological link showing that neuroendocrine factors and retinoic acid signalling pathways interact with each other during foetal lung growth regulation. With this work, new insights into normal and abnormal foetal lung development were brought, discovering novel mechanisms to further explore as potential therapeutic targets into CDH field.

O desenvolvimento pulmonar é um processo complexo que envolve a combinação e funcionamento coordenados de várias vias e mecanismos de sinalização, a fim do crescimento pulmonar normal. A hipoplasia pulmonar surge como resultado do desenvolvimento anormal do pulmão fetal estando associada a elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A compreensão do crescimento do pulmão fetal normal e anormal, tornou-se clinicamente relevante pelo facto de poder oferecer novas perspetivas no tratamento de doenças pulmonares. Independentemente dos recentes avanços no conhecimento do desenvolvimento pulmonar, ainda há muito que é preciso fazer, ser elucidado e investigado. O objetivo principal desta dissertação de doutoramento foi investigar novos reguladores fisiológicos de crescimento do pulmão fetal, a fim de encontrar uma terapia pré-natal para reverter a hipoplasia pulmonar fetal no contexto da Hérnia Diafragmática Congénita (HDC). Por outro lado, foi descoberto e estabelecido um elo de ligação entre duas vias de sinalização (via do ácido retinóico e fatores neuroendócrinos) já bem conhecidas e estudadas como sendo importantes ao longo do desenvolvimento pulmonar fetal. Foram utilizadas técnicas moleculares/histológicas e estudos de ganho-perda de função com o modelo do nitrofeno em rato e com amostras humanas. Nesta tese de doutoramento, foi demonstrado que as efrinas B1,-B2 e o recetor eph B4 são expressos durante todas as fases de desenvolvimento pulmonar fetal. Além disso, a efrina B1 e o recetor eph B4 expressaram-se essencialmente no mesenquima enquanto que a efrina B2 apresentou ter uma expressão epitelial. A administração de efrina B1 e –B2 em culturas de explantes pulmonares, contribuiu para aumentar a ramificação pulmonar fetal, embora o aumento observado não tenha significado biológico relevante. Outro achado interessante ao longo deste trabalho de Doutoramento, foi a importância dos microRNAs na fisiopatologia da HDC em humanos. O microRNA 10a e o microRNA 200b estão aumentados em pulmões humanos com HDC quando comparados com pulmões normais e a sua expressão está também alterada no fluido traqueal em crianças que sobrevivem ou morrem à oclusão fetal da traqueia (FETO). Nos pacientes que sobrevivem depois do FETO, após se remover o balão da traqueia, o fluido traqueal apresentou uma maior expressão de miR-10a e da família do miR-200 quando comparados com os não sobreviventes. Por outro lado, nos sobreviventes, a expressão desses microRNAs aumentou significativamente após a remoção do balão quando comparada com a expressão observada no momento da inserção do balão na traqueia. Em linha com o segundo objetivo acima mencionado, decidimos revesitar duas vias de sinalização já conhecidas e aparentemente não relacionadas, e descobrir uma ligação entre elas, pelo facto de ambas estarem alteradas na HDC (défice de ácido retinóico e aumento dos fatores neuroendócrinos nomeadamente da bombesina e da grelina). Descobrimos que os fatores neuroendócrinos atuam como reguladores do crescimento pulmonar, sensibilizando os pulmões para a ação do ácido retinóico através do aumento da expressão dos seus recetores (RAR α e RAR γ). Para concluir, nesta tese, mostramos que as efrinas parecem ser fortes candidatos para atuar como morfogéneos ou como fatores importantes na regulação vascular ao invés de serem um mecanismo importante de regulação do crescimento pulmonar. Por outro lado, descobrimos que os microRNAs são uma ferramenta importante que poderá vir a ser utilizada como um biomarcador de prognóstico em crianças com HDC. Adicionalmente, estabelecemos uma nova ligação fisiológica mostrando que os fatores neuroendócrinos e a via de sinalização do ácido retinóico interagem entre elas durante a regulação do crescimento fetal pulmonar. Com este trabalho, hipotetizámos novas abordagens sobre o desenvolvimento/regulação do pulmão fetal normal e anormal, descobrindo-se novos mecanismos para continuar a explorar como potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da HDC.