Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/39671

TitleMesenchymal stem cells culture on poly(vinylidene fluoride) piezoelectric microspheres
Author(s)Almeida, Ana Rita Sobreiro
Advisor(s)Gómez-Ribelles, J. L.
Lanceros-Méndez, S.
Issue date2015
Abstract(s)Nos últimos anos, as células estaminais mesenquimais (CEM’s) têm sido foco de interesse na comunidade científica devido à sua capacidade de diferenciação em diferentes linhagens celulares, tais como adipócitos, osteoblastos e condrócitos. Neste trabalho, CEM’s humanas foram combinadas com poli(fluoreto de vinilideno), PVDF, um polímero piezoelétrico biocompatível, de modo a impulsionar a sua expansão e proliferação in vitro, com o objetivo principal de obter um substancial número de células com fenótipo osteoblástico para regeneração de tecidos. Com este propósito, filmes de PVDF em fase α foram submetidos a electrospray com diferentes tempos de deposição, dando origem a dois substratos, com alta e baixa concentração de micropartículas de β-PVDF. Foram também produzidas micropartículas sem substrato com vista a criar um ambiente 3D e filmes planos de β-PVDF foram usados como referência. Antes do cultivo celular, os marcadores superficiais celulares característicos de CEM’s (CD105, CD90 e CD73) foram analisados por citometria de fluxo (CF). Quatro dias depois de serem cultivadas nos biomateriais, a viabilidade celular foi examinada. Em paralelo, CF, microscopia eletrónica de varrimento (MEV) e ensaios de imunocitoquímica de vinculina foram realizados de modo a avaliar a manutenção da multipotencialidade das CEM’s e a sua morfologia nos diferentes substratos. Quando a confluência celular foi atingida, foi introduzido um meio de diferenciação osteogénico e o cultivo continuou por 14 dias. Finalmente, CF e um ensaio de imunocitoquímica de osteocalcina foram realizados de modo a avaliar como as diferentes topografias dos biomateriais influenciavam a diferenciação osteogénica. A primeira análise de CF confirmou que as células utilizadas eram CEM’s humanas. No quarto dia, os resultados de MTS mostraram que a proliferação foi similar em todos os substratos. A MEV e o ensaio de imunocitoquímica de vinculina mostraram que as CEM’s adotaram diferentes morfologias dependendo do biomaterial. Adicionalmente, CF mostrou uma perda de marcadores específicos das CEM’s em meio de expansão e 14 dias depois da introdução de meio osteogénico, as células cultivadas nos filmes planos e com micropartículas revelaram existência de osteocalcina e perda de marcadores. Concluindo, as novas topografias com micropartículas de PVDF permitiram um incremento na diferenciação de CEM’s. As células proliferaram satisfatoriamente e a morfologia adotada nos substratos sugere aderência às microesferas. Concluindo, estes suportes mostraram induzir perda de multipotencialidade das CEM’s cultivadas em meio de expansão, mesmo antes da confluência celular.
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have attracted great interest in the scientific community in the past few years due to their differentiation potential towards cells belonging to the musculoskeletal lineages, such as adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes. In this work, human MSCs were combined with poly(vinylidenefluoride) (PVDF), a biocompatible piezoelectric polymer, allowing their in vitro expansion and proliferation, with the main goal of obtaining an important number of cells with osteoblastic phenotype for tissue regeneration. With this purpose, α-phase PVDF films were subjected to PVDF electrospray with different deposition times, producing two substrates, with high and low concentration of β-phase PVDF microspheres. Microspheres only were also produced to create a 3D environment. Flat β-phase films were used as reference. Before cell seeding, the characteristic cell surface markers of MSCs (CD105, CD90 and CD73) were analyzed by flow cytometry (FC). Cells were cultured onto the biomaterials and viability was assessed after 4 days. In parallel, FC, Scanning Electron Microscopy (SEM) and immunocytochemistry of vinculin were performed in order to evaluate the maintenance of MSCs multipotentiality and their morphology on the different substrates. When the confluence was reached, osteogenic differentiation medium was introduced and the culture was continued for 14 days. Finally, FC and an osteocalcin immunocytochemistry were performed in order to evaluate if the different substrate morphologies influenced MSCs osteogenic differentiation. First FC analysis confirmed that cells were actually human mesenchymal stem cells. At the fourth day, MTS results showed similar proliferation in all the substrates. SEM and vinculin immunocytochemistry have shown that a different morphology was adopted by MSCs depending on the substrate. Also, FC indicated loss of specific MSCs markers in expansion medium. After 14 days of osteogenic medium introduction, cells cultured on flat films and films with microspheres revealed osteocalcin staining and again, loss of multipotentiality. Concluding, this new shaped PVDF microspheres substrates were able to enhance hMSC’s differentiation. Cells proliferated at high rate and their morphology in the substrates suggests that these cells are adhering onto microspheres. Moreover, these supports’ topography induces loss of multipotenciality in MSCs cultured in expansion medium, even before reaching confluence.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas
URIhttp://hdl.handle.net/1822/39671
AccessOpen access
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
CDF - FMNC - Dissertações de Mestrado/Master Thesis

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