Clivagem e caracterização de frutalina recombinante produzida em Escherichia coli

Abstract

A frutalina é uma lectina extraída de sementes de fruta-pão (Artocarpus incisa). É uma proteína glicosilada com peso molecular de 48-49 kDa e organizada em tetrâmeros, sendo cada um composto por uma cadeia α e uma cadeia β . É uma lectina do grupo das jacalinas com afinidade de ligação a galactose e com aplicações biomédicas como biomarcador, imunomodulador e propriedades anti-tumorais. A frutalina é, no entanto, composta por várias isoformas que a tornam uma mistura heterogénea e cuja quantidade relativa de cada uma das isoformas varia de extração para extração. A introdução de tecnologia recombinante permite obter uma solução com uma única isoforma com propriedades definidas e permite a inclusão de parceiros de fusão por forma a melhorar os rendimentos de produção e facilitar a sua purificação e reduzir as perdas associadas ao processo. Estudos anteriores demonstraram atividade citotóxica de frutalina recombinante produzida em Pichia pastoris mesmo não ocorrendo a excisão do linker entre as cadeias a e b. O mesmo não aconteceu com frutalina recombinante produzida em Escherichia coli que não demonstrou atividade citotóxica. O presente trabalho pretende caracterizar uma versão de frutalina recombinante produzida em E. coli contendo como parceiro de fusão o promotor de solubilidade Trx e uma cauda de histidinas por forma a facilitar a sua purificação (TrxFTL). Esta versão de frutalina contem ainda dois locais de ação da TEV protease: um entre as cadeias e outro que separa as cadeias do parceiro de fusão. A análise SDS-PAGE indica que digestão com TEV protease removeu o parceiro de fusão, no entanto é inconclusiva quanto à separação das cadeias. O método de purificação usado, a cromatografia de afinidade ao níquel reversa demonstrou ser um método eficaz na purificação da frutalina clivada (rFTL). A frutalina recombinante não demonstrou atividade hemaglutinante em hemácias de coelho, quer antes quer após digestão. Embora a rFTL tenha demonstrado afinidade à metil-α-D-galactose em ensaios de fluorescência, não apresentou afinidade à galactomanana reticulada de Adenanthera pavonina. Foi ainda efetuada a desnaturação da TrxFTL e rFTL, para aumentar a acessibilidade da TEV protease, tendo resultado, no caso da TrxFTL, num aumento do comprimento de onda de intensidade de fluorescência máxima e numa diminuição de intensidade de fluorescência.

Frutalin is a lectin extracted from breadfruit seeds (Artocarpus incisa). It is a glycosylated protein with a molecular weight of 48-49 kDa and organized in tetramers, each one composed of a α chain and a β chain. It belongs to the jacalin related group of lectins with binding affinity for galactose and it has biomedical applications as a biomarker, immunomodulator and anti-tumor properties. Frutalin, however, is a heterogeneous mixture of several isoforms, whose relative amount of each isoform varies with the extraction. The introduction of recombinant technology allows obtaining a solution with a single isoform, and thus more defined properties, and allows the inclusion of fusion partners to improve production yields, facilitate purification, and reduce the losses associated with the process. Previous studies have demonstrated the cytotoxic activity of the recombinant frutalin produced in Pichia pastoris even without the excision of the linker between the α and β chains. However, recombinant frutalin produced in Escherichia coli did not show cytotoxic activity. This thesis aims to characterize a recombinant version of frutalin produced in E. coli containing as fusion partner the solubility promoter Trx and a histidine tag to facilitate the purification (TrxFTL). This frutalin version contains also two sites of action of TEV protease: one between the chains and other for separating the chains from the fusion partner. SDS-PAGE analysis indicated that TEV protease digestion removed the fusion partner; however, it was not conclusive regarding chains separation. The purification method used, nickel affinity reverse chromatography, proved to be an effective method for the purification of cleaved frutalin (rFTL). Recombinant frutalin showed no HA on rabbit erythrocytes, both before and after digestion. Although rFTL has demonstrated affinity for methyl-α-D-galactose in fluorescence assays, it showed no affinity for crosslinked galactomannan from Adenanthera pavonina. It was further performed the denaturation of TrxFTL and rFTL, to increase the accessibility of the TEV protease, resulting, in the case of TrxFTL, in an increase in the wavelength of the maximum fluorescence intensity and a decrease in the fluorescence intensity.