Bacterial cellulose as a novel substrate for retinal pigment epithelium cells transplantation in age-related macular degeneration

Abstract

Bacterial cellulose (BC) has been increasingly recognized for its great potential in a number of biomedical applications, due to its unique properties such as high mechanical strength, biocompatibility and non-toxicity. The feasibility of BC as a novel substrate for retinal pigment epithelium (RPE) transplantation was addressed in this thesis. BC sheets were produced in static cultures of Gluconacetobacter xylinus bacteria, sliced into thin films and dried. Two approaches were adopted to modify the BC surface: acetylation and polysaccharide adsorption using carboxymethyl-cellulose or chitosan. The first approach decreases the BC hydrophilicity, while the second increases protein adsorption through incorporation of carboxyl or amine groups. The modified substrates were characterized according to the relevant properties for the envisaged application: surface chemistry, wettability, free energy, topography; and bulk properties such as permeability, dimensional stability, tensile strength and level of endotoxins. Their ability to promote RPE cell adhesion and proliferation in vitro was also studied using the hTERT-RPE1 immortalized cell line. The impact of an extracellular matrix, the urinary bladder matrix (UBM), in cell response was studied, as well as the cell morphology using UBM-coated substrates. Acetylation decreased substrate swelling and the amount of endotoxins present. All modified BC substrates were porous and permeable to 35 and 300 kDa polysaccharide solutes. The moderate hydrophilic surface of acetylated BC (ABC) substrates was maintained after UBM coating. Surface modification greatly enhanced the adhesion and proliferation of hTERT-RPE1 cells in BC. Although similar proliferation rates were observed among the modified BC substrates, the ABC with UBM substrate exhibited the closest profile to the control surface (polystyrene). Cells adhered to UBM-coated ABC express the RPE cell markers: ZO-1 (junction protein) and RPE65 (protein involved in the visual cycle of retinal). HTERT-RPE1 cells cultured in UBM-coated ABC substrates were also able to develop transepithelial resistance, showing polygonal shape cell morphology in a monolayer configuration with the development of microvilli. In summary, this study emphasises the great potential of BC as a substrate for RPE transplantation. However, studies of RPE cell function in these substrates using primary RPE cells, as well as in vivo assays to infer the substrates biocompatibility are still required.

A celulose bacteriana (CB) tem sido progressivamente reconhecida pelo seu potencial em diversas aplicações biomédicas devido a propriedades únicas como elevada resistência mecânica, biocompatibilidade e ausência de toxicidade. Nesta tese é avaliado o potencial da CB como substrato para o transplante do epitélio pigmentar da retina (EPR). A CB foi produzida em culturas estáticas da bactéria Gluconacetobacter xylinus, fatiada em filmes finos e desidratada. Foram adoptados dois tipos de modificação de superfície da CB: acetilação e adsorção de quitosano ou carboximetil-celulose. A primeira modificação reduz a elevada hidrofilicidade da CB, enquanto a segunda aumenta a adsorção proteica pela incorporação de grupos amina ou carboxilo. Os substratos modificados foram caracterizados de acordo com as propriedades relevantes para a aplicação pretendida: composição química, grau de hidrofilicidade, energia livre e topografia da superfície; assim como permeabilidade, nível de endotoxinas, estabilidade dimensional e propriedades mecânicas. De seguida foi avaliada a capacidade das células do EPR aderirem e proliferarem nos substratos, utilizando a linha celular imortalizada hTERT-RPE1. O impacto na resposta celular de uma matriz extracelular, a matriz da bexiga (MB), e a morfologia de células do EPR foram estudados em substratos com MB. A acetilação diminuiu o nível de inchamento e de endotoxinas do material. Todos os substratos desenvolvidos demonstraram ser porosos e permeáveis a polissacáridos de 35 e 300 kDa. A hidrofilicidade moderada da superfície da CB acetilada (CBA) manteve-se após adsorção da MB. A modificação da BC aumentou significativamente a adesão e proliferação das células hTERT-RPE1. Embora as taxas de proliferação celular tenham sido semelhantes para os vários substratos de CB modificada, a CBA com MB revelou o perfil mais similar ao controlo (plástico). Verificou-se que as células aderidas à CBA com MB expressam os marcadores proteicos do EPR: ZO-1 (proteína de junções intercelulares) e RPE65 (proteína envolvida no ciclo visual de retinal). As células cultivadas em CBA com MB foram também capazes de desenvolver resistência transepitelial e uma morfologia poligonal em monocamada com microvilosidades. Em suma, este estudo enfatiza o enorme potencial da CB como substrato para o transplante do EPR. Contudo ainda será necessário efetuar estudos do funcionamento das células do EPR nos substratos utilizando para o efeito células primárias, bem como estudos in vivo que permitam aferir a biocompatibilidade destes substratos.