Cationic Liposomes as antigenic delivery systems: development of an immunoprotective strategy against Candida albicans

Abstract

Os lipossomas catiónicos constituídos pelo lípido catiónico Brometo de Dioctadecil Dimetilamónio (DODAB) são sistemas de entrega eficazes com poder adjuvante, possibilitando a proteção/veiculação do antigénio, tendo sido anteriormente descritos como imuno-estimuladores. Assim, o principal objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento e caracterização de lipossomas, constituídos pelo DODAB e pelo lípido não-iónico Monooleína (MO), com poder adjuvante para o establecimento de uma estratégia imunomoduladora contra infecções sistémicas causadas pelo fungo Candida albicans. Inicialmente, demonstrámos que o aumento na concentração de MO melhora a estabilidade coloidal, a viabilidade e a internalização celular quer dos lipossomas vazios, quer carregados com BSA (BSA nanoparticulas liposomais (LNPs). Estes lipossomas foram internalizados via endocitose, sendo que a internalização da BSA foi aumentada quando veiculada pelos lipossomas. Selecionámos a razão molar DODAB:MO (1:2) como a mais adequada e demonstrámos que este sistema para além de funcionar como um nanotransportador também aumenta a ativação de células apresentadoras de antigénio (APC). Esta mesma razão molar foi selecionada para preparar sistemas de entrega de antigénios (ADSs LNPs) carregados com proteínas da superfície da parede celular de C. albicans (CWSP). Foram avaliadas as propriedade físico-químicas destas ADSs LNPs a diferentes razões de massa entre as proteínas e os lípidos (p/l) para selecionar duas formulações ADS1 (p/l 0.056) e ADS2 (p/l 0.376). Ambas as formulações apresentaram estabilidade coloidal, carga superficial negativa, tamanho médio de cerca de 200 nm e não provocaram efeitos citotóxicos. Estudos in vitro possibilitaram verificar que os ADSs induzem uma libertação lenta das CWSP e, como tal, prolongam a estimulação das APCs, tendo sido confirmado o seu potencial imunogénico em estudos in vivo, usando ratinhos BALB/c imunizados com os ADSs. Neste sentido, usando um modelo murino (BALB/c) de candidíase disseminada, mostrámos que a imunização com ADS1 prolonga a sobrevida dos ratinhos, comparando com ratinhos imunizados com as CWSP livres. A resposta humoral observada distingue-se pela existência de anticorpos específicos capazes de aumentar a fagocitose de C. albicans, e a resposta celular específica desenvolvida apresenta o fenótipo Th1/Th17, conhecido como protetor neste tipo de infeções. Em resumo, os resultados apresentados nesta tese, revelam o potencial dos lipossomas DODAB:MO como sistemas de entrega de antigénios com poder adjuvante.

Cationic liposomes, composed by the cationic synthetic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) are effective adjuvant delivery systems that offer antigen protection and have been shown to be immunostimulatory. Thus, the main objective of this thesis was the design and characterization of a novel adjuvant delivery system composed by DODAB and the neutral lipid monoolein (MO) for use as an imunomodulatory strategy against Candida albicans systemic infections. Initially, we demonstrated that DODAB:MO liposomes, empty or loaded with BSA (BSA Liposomal Nanoparticles, LNPs), benefit in terms of colloidal stability, cellular viability and uptake with the increase in MO molar fraction. Both empty liposomes and BSA LNPs were internalized by endocytosis, with increasing BSA uptake upon loading in DODAB:MO liposomes. The most suitable molar ratio of DODAB:MO (1:2) was selected and we demonstrated that this formulation not only acts as antigen nanocarrier, but also enhances activation of bone marrow derived dendritic cells (BMDCs). Following, we used these liposomes to prepare antigen delivery systems liposomal nanoparticles (ADS LNPs) with C. albicans cell wall surface proteins (CWSP) as antigens. The physicochemical properties of these LNPs were assessed at different protein/lipid weight ratio (p/l) and selected two formulations ADS1 (p/l of 0.056) and ADS2 (p/l of 0.376). Both ADSs exhibited negatively charged surfaces with mean sizes of approximately 200 nm, good colloidal stability and no associated cytotoxicity. ADSs LNPs not only enhanced but also prolonged BMDCs activation, indicating that entrapped antigen is released in a slow and sustained manner. ADSs immunized mice provided evidence that the LNPs could have potential to be use in an immunoprotective strategy against disseminated candidiasis. Finally, in a murine (BALB/c) model of systemic candidiasis, we showed that mice immunized with ADS1 LNPs significantly extended mice survival in comparison with mice immunized with free CWSP. Mice vaccinated with ADS1 LNPs developed a strong humoral response with specific antibodies able to enhance phagocytosis of C. albicans cells and boost a protective and specific Th1/Th17 response. In summary, in this thesis we show that DODAB:MO-based liposomes can act as adjuvant delivery systems and confer immunoprotection against C. albicans systemic infections.