Insights into the role of biochemical factors and extracellular matrix environment during chondrocyte culture: relevance on articular cartilage repair strategies

Abstract

Chondrocytes, the only cellular type present in articular cartilage, and the extracellular components of their matrix, have become the focus of several investigations driven by tissue engineering, basic and clinical research fields seeking to improve the current clinical approaches to repair cartilage. Articular chondrocytes are the obvious cell source for cartilage regeneration and are nowadays the state of the art for several clinical procedures. The harvest of a sufficient number of autologous primary cells and preservation of their somatic phenotype memoir are the first major issues concerning the actual clinical approaches to repair cartilage lesions. Due to the abovementioned limitations of articular chondrocytes, stem cells from different sources have been used as an alternative cell source in cartilage repair. Due the intrinsic plasticity, adult or embryonic stem cells can be a supporting tool for new ideas and strategies in cartilage tissue engineering. So, using a non-direct contact culture system composed of human umbilical wharton’s jelly stem cells and human articular chondrocytes, we demonstrated an in vitro cartilaginous strengthening of the uncommitted stem cells. Chondrocytes secreted soluble factors were able to enhance wharton’s jelly gene expression of cartilage markers over time with augmentation of cartilage extracellular proteins deposition in pellet culture. The use of platelet lysate (PL) in human articular chondrocyte culture augmented cellular kinetic growth with the maintenance of their somatic cartilaginous phenotype memoir provided evidences by the performed in vitro and in vivo assays. The role of platelet lysate on human chondrocytes depends on the environment. Physiological or inflammatory conditions were also addressed in the first part of the thesis. It is demonstrated that PL plays a key role in inflammation resolution: causing a boost of inflammatory cytokines with subsequent decrease of COX2 expression and NF-kB activation values. Furthermore, PL has shown to have a strong chemotactic effect on human articular chondrocytes particularly under mimicked inflammatory conditions. A serious limitation of the paradigmatic use of biomaterials, with micro and/or nano dimensions, is their biocompatibility effect on the target cells. The development of new biomaterials for cartilage in situ delivery and the study of their effect on articular cartilage resident cells was other aim. Novel Hyaluronic acid (HA) microparticles were made and characterized. The presence of HA microparticles, in direct and non-direct contact with chondrocytes did not interfere with cellular viability and growth over time. In the aforementioned conditions, cells retained their gene expression profile and their expression of cluster of differentiation 44 (CD 44) confirming the potential use of HA microparticles in a cartilage tissue engineering strategy. Polyelectrolyte polymer complexes for cartilage tissue engineering can be potentially advantageous. HA, polyanion polysaccharide and one of the main components of chondrocyte extracellular matrix, and poly-L-lysine (PLL), polycation known for its biocompatibility and adhesion properties were used to form polyelectrolytes structures. The final size and structure stability of the formed nano complexes was demonstrated to be dependent of polymers combined ratios and solution salt molarity. The possibility to deliver cells within the cartilage lesion site has been focus of research in the last years as a new frontier in cell-base strategies. In the final part of this thesis, we developed a biodegradable injectable hydrogel to be use as a delivery vehicle for human articular chondrocytes. The novel hydrogel has able to support chondrocyte viability and proliferation. Encapsulated cells retained their capacity to form a neocartilaginous tissue positive for human type II collagen as demonstrated by both in vitro and in vivo evidences. In overall, the work exposed in this thesis presents valid insights into the role of biochemical factors and extracellular matrix environment during chondrocyte culture. Observations can potentially have high relevance on articular cartilage repair strategies.

Os condrócitos articulares são a fonte celular mais utilizada em ensaios clínicos para reparar e regenerar defeitos articulares. Neste âmbito, um dos maiores aspectos limitantes do uso autólogo deste tipo celular é a dificuldade em obter um número suficiente de células mantendo, ao mesmo tempo, a sua memória fenotípica, ambos necessários para o sucesso final da sua utilização. Devido a este facto, a utilização de células estaminais adultas ou fetais tem vindo a ser considerada uma forte alternativa ao uso das células somáticas deste tecido conectivo. Assim, modelar a plasticidade fenotípica estaminal e direccioná-la para um possível diferenciamento cartilagíneo, é de fundamental importância. Neste contexto, pretendeu-se, num sistema de co-cultura indirecta entre células Wharton Jelly de cordão umbilical e condrócitos articulares, ambos humanos, incrementar o potencial condrogénico das células estaminais. Factores de crescimento produzidos pelos condrócitos foram capazes de agir paracrinamente e aumentar a expressão génica de marcadores cartilagíneos em células de Wharton Jelly. Pellets destas células cultivadas na presença de condrócitos apresentaram uma maior deposição de matriz extracelular comparada com as cultivadas na ausência de condrócitos. O uso de derivados de sangue, bem como de biomateriais em engenharia de cartilagem, tem aumentado nos últimos anos. A utilização de lisados de plaquetas em substituição do soro bovino incrementou a capacidade replicativa dos condrócitos articulares humanos mantendo, ao mesmo tempo, a sua capacidade de diferenciação, como se demonstrou nos testes in vitro e in vivo. Na presença de estímulos inflamatórios, os lisados das plaquetas causam nos condrócitos um forte aumento inicial da secreção de proteínas inflamatórias que, com o decorrer do tempo, decresce acompanhado da redução da expressão da ciclo-oxigenase2, assim como dos valores de activação de NF-Kb. Para além disto, os lisados das plaquetas têm um efeito atractivo nos condrócitos em particular em situações de inflamação. Um dos aspectos importantes da utilização de biomateriais é a sua biocompatibilidade com as células alvo da sua utilização. Uma parte desta tese foi focalizada no estudo e desenvolvimento de novos biomateriais para utilização in situ na regeneração cartilagínea e respectivo efeito nos condrócitos. Foram desenvolvidas e caracterizadas inovadoras micro partículas de ácido hialurónico. A viabilidade celular dos condrócitos articulares não foi significativamente alterada quando estes foram cultivados na presença directa ou indirecta das micro partículas. As células mantiveram a expressão dos seus marcadores genéticos característicos, assim como a expressão do marcador de membrana CD44, o que indica que as micro partículas de ácido hialurónico poderão ter um bom potencial em estratégias de reparo e regeneração da cartilagem. O uso de complexos polieletrólitos em engenharia de tecidos da cartilagem pode trazer grandes benefícios. Ácido hialurónico é um dos componentes da matriz extracelular cartilagínea com carga negativa o que lhe confere a possibilidade de conjugar-se com polímeros de carga oposta. A poli-lisina é um polímero de carga positiva, altamente bio compatível, e com propriedades de adesão. A união destes dois polímeros originou a formação de complexos polieletrólitos. A formação destas estruturas, a sua carga e dimensões, estão fortemente dependentes dos ratios de polímeros utilizados. A possibilidade de injectar células no local da lesão cartilagínea tem sido, na última década, fonte de investigação no campo da engenharia de tecidos da cartilagem. Na parte final desta tese, foi desenvolvido um gel biodegradável e termosensível, para injectar os condrócitos articulares humanos, no local lesionado da cartilagem. Neste contexto, foi utilizado este gel inovador no qual os condrócitos encapsulados mantiveram a sua vitalidade e capacidade proliferativa. As células encapsuladas mantiveram a sua memória fenotípica, formando um novo tecido cartilagíneo positivo para a presença de colagénio de tipo II, em ambos os estudos, in vitro e in vivo. O trabalho exposto nesta tese revela propostas inovadoras e funcionais na cultura de condrócitos. Estas observações são muito relevantes, em novas estratégias na engenharia de tecidos da cartilagem.

I danni della cartilagine, sia traumi che progressiva degenerazione, portano a una perdita della funzione dell’articolazione a causa dell’incapacità del tessuto di rigenerarsi. Sebbene si siano sviluppate diverse tecniche chirurgiche, nessuna ha mai avuto un successo consistente, e le strategie terapeutiche attuali sono orientate verso l’impiego dell’ingegneria tessutale. I condrociti articolari sono considerati la fonte cellulare ideale in diverse procedure cliniche ricostruttive del tessuto cartilagineo. Il loro limitato potere proliferativo e la difficoltà di recuperare tessuti sani, da cui prelevare ed isolare condrociti limitano l’impiego di queste cellule in medicina rigenerativa. L’utilizzo di cellule staminali fetali o adulte altamente plastiche e differenzianti, potrebbe essere una fonte alternativa per sviluppo di approcci per la rigenerazione di cartilagine. In questo contesto, in uno degli studi riportati, abbiamo allestito co-culture di cellule staminali derivate dalla gelatina ombelicale di Wharton e chondrociti articolari. Le cellule non sono state coltivate in contatto diretto, i fattori solubili secreti dai condrociti hanno aumentato il potenziale differenziativo in senso condrogenico delle cellule di Whorton; è stato osservato inoltre nelle culture in vitro un aumento di geni specifici espressi in cartilagine e deposito di matrice extracellulare cartilaginea. Negli ultimi anni l‘uso dei derivati piastrinici e biomateriali biodegradabili è da considerarsi una pratica comune per la rigenerazione di danni cartilaginei. La somministrazione di lisato piastrinico a coltura in vitro di condrociti articolari umani determina un aumento della proliferazione cellulare e il mantenimento delle caratteristiche somatiche delle cellule cartilaginee. Nella prima parte della tesi ho studiato l’effetto dei derivati piastrinici in colture di condrociti umani coltivati in vitro in condizioni fisiologiche e/o infiammatorie. E’ stato dimostrato che il lisato piastrinico (PL) svolge un ruolo importante nella risoluzione del processo infiammatorio; il trattamento delle cellule con PL determina un iniziale repentino aumento di citochine infiammatorie seguito da una graduale diminuzione dell’espressione di classici stimoli infiammatori quali, COX2 e l’attivazione della via del segnale regolata da NF-kB. Inoltre, è stato evidenziato che in colture di condrociti articolari coltivati in presenza di stimoli infiammatori, i derivati piastrinici determinano un effetto chemiotattico. Un secondo aspetto che abbiamo voluto affrontare nella tesi riguarda l’uso di biomateriali nei processi di rigenerazione cartilaginea. I nuovi biomateriali devono essere biocompatibili, presentare micro e/o nano dimensioni ideali per veicolare nel sito di lesione cellule e molecole in grado di ricostituire un tessuto. Micro-particelle di acido ialuronico (HA) di nuova generazione sono state utilizzate per coltivare in vitro condrociti umani. Abbiamo dimostrato che la presenza del biomateriale non interferisce sulla vitalità e crescita cellulare, le cellule mantengono un profilo di espressione genica tipico cartilagineo, ciò conferma il potenziale utilizzo di micro-particelle di acido ialuronico per rigenerare cartilagine. L’utilizzo di complessi polimerici polielettrolitici potrebbe essere molto vantaggioso per ottimizzare biomateriali da utilizzare in ambito cartilagineo. Il polisaccaride HA, uno degli elementi fondamentali della matrice extracellulare dei condrociti, insieme alla poly-L-lysina (PLL), polimero policationico conosciuto per le sue proprietà adesive, sono stati utilizzati per formare strutture polielettrolitiche. Nello studio abbiamo caratterizzato le dimensioni e la stabilità strutturale del nano complesso sviluppato. In fine abbiamo voluto studiare possibili approcci per veicolare cellule nel sito di lesione e sviluppare nuovi approcci cellulari da utilizzare in campo clinico per il riparo della cartilagine. A tal fine, abbiamo sviluppato un’idrogel iniettabile biodegradabile in grado di trasportare condrociti articolari umani. Studi condotti in vitro ed in vivo hanno dimostrato che il nuovo idrogel non interferisce con la vitalità e la proliferazione delle cellule, anzi i condrociti incapsulati all’interno del gel crescono e sono in grado di depositare matrice extracellulare e formare nuovo tessuto cartilagineo. In conclusione, in questo studio si evince che fattori biochimici, matrice extracellulare e nuovi biomateriali giocano un ruolo rilevante nel guidare i condrociti umani a rigenerare nel sito di lesione un nuovo tessuto.