Development of enzymatic and molecular methods for the detection of Escherichia coli, total coliforms and Vibrio cholerae in water samples

Abstract

Water is one of the major sources of transmission of pathogen microorganisms worldwide and outbreaks of waterborne diseases (e.g. cholera, typhoid fever) are a reality. Globally, these outbreaks have an enormous impact, which is particularly noticed in developing countries, becoming essential to constantly evaluate the microbiological quality of the water. For such purpose, methods based in the detection of total coliforms and, in particular, Escherichia coli are used as indicators of faecal contamination and of enteric pathogens in water. The methods currently available for microbiological water quality monitoring provide results with a considerable delay, lacking on specificity and sensitivity. The aim of this thesis was to develop methods for the detection of indicator microorganisms in water samples, having as final goal the application of these methods to water quality monitoring. This study was initiated on November 2009 and finished in October 2013, and was divided in three main goals: development of an enzymatic culture medium for the detection of E. coli and total coliforms in environmental samples, development of a sample preparation method to concentrate and recover microbial cells from 100 mL of water samples to detect E. coli and total coliforms by standard polymerase chain reaction (PCR) and real-time polymerase chain reaction (rtPCR), and development of a method to detect Vibrio cholerae in ballast water, using rtPCR. The enzymatic culture medium was based in identifying the activity of the enzymes β-Dglucuronidase and β-D-galactosidase, which are specific to the indicators E. coli and total coliforms, respectively. A medium in the form of a powder was developed, being capable of detecting as little as one target indicator in 1 mL of drinking and river waters after 14 to 18 h of incubation, and in seawater, after 24 h of incubation. In order to evaluate the adaptability of PCR-based methods to detect total coliforms and E. coli in water quality monitoring and with the purpose of reducing the assay time, a sample preparation method to concentrate and recover cells from water samples was developed, without the need of culturing the microorganisms. The final protocol was able to detect 104 CFU/100 mL in approximately 6 h by standard PCR and in 3 h by real-time PCR in bacterial suspensions of water. Nevertheless, PCR-based methods are highly sensitive to contaminations and inhibitions, being necessary further research in order to adapt this technique to environmental samples of water. The addition of a molecular decontamination and a molecular enrichment steps will undoubtedly drive this method further by reducing contamination and increasing the limit of detection. Ballast water is one of the major sources of transmission of waterborne microorganisms worldwide and has been correlated to outbreaks of cholera disease. In order to improve the water quality monitoring of the ballast water, we aimed at creating a methodology able to detect the three major Vibrio human pathogens: Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus, by coupling an efficient sample preparation method to concentrate and recover bacterial cells with a molecular enrichment step, and detection of the target microorganisms by multiplex-rtPCR. This led to the development of a new method, named as Vibrio CRENAME-rtPCR, capable to detect 14 CFU of V. cholerae, 4 CFU of V. vulnificus and 12 CFU of V. parahaemolyticus in 100 mL of artificial seawater, in less than 5 h. In conclusion, the methods developed in this thesis have shown to have high potential to be used for assessing the microbiological quality of water, providing the results in a reduced time.

A água é uma das principais fontes de transmissão de microrganismos patogénicos em todo o mundo e epidemias de doenças transmitidas pela água (por exemplo: cólera, febre tifoide) são uma realidade. Estes surtos têm um enorme impacto no mundo, particularmente nos países em desenvolvimento, tornando-se essencial avaliar constantemente a qualidade microbiológica da água. Para cumprir este objetivo, são utilizados métodos baseados na deteção de coliformes totais e, em particular, da bactéria Escherichia coli como indicadores de contaminação fecal e da presença de patogénicos entéricos na água. Os métodos atualmente disponíveis para monitorizar a qualidade microbiológica da água fornecem os resultados com um atraso considerável, carecendo em especificidade e sensibilidade. Esta tese teve como objetivo desenvolver métodos para a deteção de microrganismos indicadores em amostras de água, tendo como propósito final aplicar estes métodos na monitorização da qualidade da água. O trabalho foi iniciado em Novembro de 2009 e terminado em Outubro de 2013, tendo sido dividido em três objetivos principais: o desenvolvimento de um meio de cultura enzimático para a deteção de E. coli e coliformes totais em amostras ambientais, o desenvolvimento de um método de preparação de amostras para concentrar e recuperar as células microbianas a partir de amostras de água de 100 ml para a deteção de E. coli e coliformes totais através das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e de reação em cadeia da polimerase em tempo real (rtPCR), e o desenvolvimento de um método para detetar Vibrio cholerae na água de lastro, usando o rtPCR. O meio de cultura enzimático baseou-se na identificação da atividade das enzimas β-Dglucuronidase e β-D-galactosidase, que são específicas para os indicadores E. coli e coliformes totais, respetivamente. Foi desenvolvido um meio sob a forma de pó, sendo capaz de detetar até uma célula do indicador alvo em 1 mL de água potável e de rio após 14 a 18 horas de incubação, e na água do mar após 24 h de incubação. No sentido de avaliar a capacidade de adaptação dos métodos baseados em PCR para detetar coliformes totais e E. coli na monitorização da qualidade da água, e com a finalidade de reduzir o tempo de análise, foi desenvolvido um método de preparação das amostras com o objetivo de concentrar e recuperar as células a partir de amostras de água, sem incluir a cultura dos microrganismos. O protocolo final foi capaz de detetar 104 unidades formadoras de colónias (UFC)/100 mL de suspensões bacterianas de água em cerca de 6 horas pelo PCR convencional, e em cerca de 3 horas pelo rtPCR. No entanto, os métodos baseados em PCR são altamente sensíveis a contaminações e inibições, pelo que é necessário continuar o estudo da adaptação desta técnica a amostras ambientais de água. Incluir no método etapas de descontaminação molecular e de cultura molecular irá, sem dúvida, aperfeiçoar este método por reduzir a contaminação e aumentar o limite de deteção. A água de lastro é um dos mais importantes veículos de transmissão de microrganismos através da água em todo o mundo e tem sido relacionada com surtos de cólera. No sentido de contribuir para um avanço na monitorização da qualidade da água de lastro, visamos desenvolver uma metodologia capaz de detetar os três principais patogénicos humanos Vibrio: Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus, associando um método eficiente para preparar as amostras por concentração e recuperação das células bacterianas, com um passo de cultura molecular, e deteção dos microrganismos alvo por multiplex-rtPCR. Isto levou ao desenvolvimento de um novo método, denominado como Vibrio CRENAME-rtPCR, capaz de detetar 14 UFC de V. cholerae, 4 UFC de V. vulnificus e 12 UFC de V. parahaemolyticus em 100 mL água do mar artificial, em menos de 5 horas. Em suma, os métodos desenvolvidos nesta tese provaram ter um elevado potencial de serem aplicados na avaliação da qualidade microbiológica da água, sendo os resultados visíveis num tempo reduzido.