Study of the mechanisms of transport and regulation of carboxylic acids in Candida albicans and Candida glabrata

Abstract

As leveduras oportunistas mais prevalentes em humanos são as espécies de Candida. Candida albicans e Candida glabrata colonizam frequentemente nichos pobres em glucose, o substrato preferencial destes organismos. Contudo, fontes alternativas de carbono, tais como ácidos carboxílicos de cadeia curta, estão frequentemente presentes e a sua utilização depende do seu transporte para o interior da célula e da existência de processos metabólicos adequados para a sua utilização. Esta tese focou o estudo dos transportadores de carboxilatos Jen1 e Jen2 e sua regulação em Candida albicans e Candida glabrata, bem como o estudo de Jen1 em Saccharomyces cerevisiae, organismo em que foi descrito pela primeira vez. Trabalhos anteriores revelaram que os transportadores Jen1 e Jen2 de C. albicans são expressos em ambientes pobres em glucose dentro do hospedeiro, o que sugere a sua importância no início de uma infeção. Nesta tese estudou-se a resistência aos antifúngicos em biofilme assim como a formação deste em estirpes interrompidas nos referidos transportadores. Verificou-se que a presença de ácido láctico no meio desencadeia um aumento da suscetibilidade ao fluconazol em C. albicans. Também se demonstrou que o duplo mutante jen1 jen2, na presença de ácido lático, pH 5.0, apresentava um biofilme mais compacto, praticamente sem hifas, bem como com maior resistência ao fluconazol comparativamente com o biofilme da estirpe selvagem. No entanto, em células planctónicas foi observado o oposto, as estirpes interrompidas nestes transportadores eram mais suscetíveis ao fluconazol comparativamente com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que os transportadores de ácidos carboxílicos têm um importante papel na formação de biofilme e na resistência aos antifúngicos. O ácido acético também está presente no hospedeiro humano, e pode ser usado pelas leveduras como fonte alternativa de carbono. Demonstrou-se que o crescimento em ácido acético influencia o comportamento de C. glabrata na formação de biofilme, resistência a antifúngicos e durante a fagocitose. Células crescidas em ácido acético evidenciaram um aumento de suscetibilidade ao fluconazol e à anfotericina B em células planctónicas e foram melhor reconhecidas, fagocitadas e mortas pelos macrófagos. Tanto em células planctónicas como em biofilme verificou-se um aumento de expressão dos genes ADY2a, ADY2b, FPS1, FPS2 e ATO3 na presença de ácido acético. Estes genes são homologos ao ADY2 e ao FPS1 de S. cerevisiae, que codificam para o transportador de acetato e para o canal de ácido acético, respetivamente. Um sistema de transporte mediado para ácido acético foi identificado em células da estirpe selvagem crescidas em meio contendo 0,1 % de ácido acético com os seguintes parâmetros cinéticos: Km de 7.6±1.7 mM e Vmax de 6.7±0.9 nmol/s/mg peso seco. No entanto, a interrupção dos genes ADY2a e FPS1 isoladamente não aboliu este mecanismo de transporte. Alterações nas fontes de carbono conduzem à reorganização dos transportadores presentes na membrana plasmática. Neste trabalho, identificaram-se alguns atores envolvidos na endocitose de Jen1 e Jen2 em C. albicans e caracterizaram-se alguns dos mecanismos envolvidos neste processo. Através da monitorização da localização subcelular de Jen1-GFP e Jen2-GFP demonstrámos que estas proteínas são reguladas pela glucose, frutose e manose ao nível da pós-tradução. A adição de glucose a células crescidas em ácido láctico levou a uma diminuição da atividade do transportador de lactato Jen1. Adicionalmente, os nossos resultados sugerem que os homólogos em C. albicans da alfa-arestina Rod1 e da fosfatase PP1, Glc7/Reg1, de S. cerevisiae, desempenham um papel na inativação do Jen1 de C. albicans pela ação da glucose, de forma semelhante ao descrito para ScJen1. Em S. cerevisiae o transportador de ácido lático Jen1 é também regulado ao nível pós-transcricional. Em células de estirpe selvagem, não se deteta expressão de Jen1 na presença de glucose ou ácido fórmico, e a proteína encontra-se presente na membrana plasmática em células crescidas em ácido láctico. Análises da degradação do RNAm de JEN1 em células das estirpes selvagens e mutantes crescidas em ácido fórmico, confirmaram que a expressão de JEN1 é regulada pós-transcricionalmente pela RNA helicase Dhh1. Em células mutantes em dhh1, os RNAm de JEN1 acumularam-se na presença de ácido fórmico sem serem traduzidos numa proteína funcional. Estes resultados revelam a complexidade da regulação da expressão de JEN1 em S. cerevisiae e evidenciam a importância de Dhh1 neste processo.

Candida sp. are the most frequent opportunistic fungal pathogens in humans. The environment of the human body is often poor in glucose, which is the preferred substrate of these organisms. However, alternative carbon sources, such as short chain carboxylic acids are present, and their utilization depends on their transport into the cell and on the existence of adequate metabolic processes for their utilization. In this thesis we aimed at studying Jen1 and Jen2 carboxylate transporters and their regulation in C. albicans and C. glabrata, as well as Jen1 of Saccharomyces cerevisiae, where it was firstly described. It has been demonstrated that C. albicans Jen1 and Jen2 are expressed within the host in glucose poor niches, and it was suggested that they are important in the early stages of infection. We observed that the presence of lactic acid in the medium triggered an increase in the susceptibility to fluconazole in C. albicans. We also found that a jen1 jen2 double mutant, in the presence of lactic acid, pH 5.0, presented a more compact biofilm with almost no hyphae as well as a higher resistance to fluconazole, compared to the wild-type. However, in planktonic cells we found the opposite, the strains disrupted in these transporters were more susceptible to fluconazole compared to the wild type strain. Our results suggested that carboxylic acids transporters have an important role in biofilm formation and in the acquisition of resistance to antifungals drugs. Acetic acid is also present within the human host and can also be used by yeasts as an alternative carbon source. We showed that growth in acetic acid influences C. glabrata behaviour in biofilm formation, antifungal drug resistance and following phagocytosis. Acetic acid-grown cells revealed an increased susceptibility to fluconazole and amphotericin B in planktonic cells and are better recognised, phagocytised and killed by macrophages. Both planktonic and biofilm cells displayed an upregulation of ADY2a, ADY2b, FPS1, FPS2 and ATO3 genes in the presence of acetic acid. These genes are homologues to ADY2 and FPS1 in S. cerevisiae, encoding an acetate transporter and an acetate channel, respectively. A mediated transport system for acetic acid uptake in wild type cells, grown in 0.1 % acetic acid medium, was identified with a Km of 7.6±1.7 mM and a Vmax of 6.7±0.9 nmol/s/mg dry weight, however the disruption of ADY2a and FPS1 genes alone did not abolish this mechanism of transport. Carbon source changes trigger the reorganization of transporters present at the plasma membrane. We attempted to identify some of the actors involved in Jen1 and Jen2 endocytosis in C. albicans and to characterize some of the mechanism underlying this process. By monitoring Jen1-GFP and Jen2-GFP subcellular localization we demonstrated that these proteins are downregulated by glucose, fructose and mannose, at a posttranslational level. Glucose addition to lactic acid induced cells led to a decrease in Jen1 lactic acid uptake capacity. Additionally, our results suggested that C. albicans homologues of S. cerevisiae alpha-arrestin Rod1 and PP1 phosphatase Glc7/Reg1 play a role in Jen1glucose inactivation, similarly to what has been described for ScJen1. In S. cerevisiae Jen1 lactate transporter is also regulated at the posttranscriptional level. In wild type cells, Jen1 expression is undetectable in the presence of glucose or formic acid being present at plasma membrane in lactate-grown cells. Analyses of JEN1 mRNAs decay in wild type and mutant strains confirmed that JEN1 expression is post-transcriptionally regulated by a RNA helicase Dhh1 in formic acid. In a dhh1 mutant strain, JEN1 mRNA accumulated in the presence of formic acid, without its translation into a functional protein. These results revealed the complexity of the expression regulation of JEN1 in S. cerevisiae and evidenced the importance of DHH1 in this process.