Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/34660

TitleEffects of ammonium on the CLS of the auxotrophic strain Saccharomyces cerevisiae BY4742 and its modulation by the key proteins Tor1p, Ras2p and Sch9p
Author(s)Correia, Fernanda Leitão
Advisor(s)Sousa, Maria João
Leão, Cecília
Issue date2014
Abstract(s)The yeast Saccharomyces cerevisiae has emerged as one of most important model organisms to clarify the environmental and genetic factors associated with aging. The nutrientsignaling pathways involved in the regulation of yeast chronological lifespan (CLS) is affected by the composition of the culture medium and therefore, culturing cells in different media leads to differences in CLS. Manipulation of components of the culture medium, such as reducing glucose concentration, is known to extend CLS. However, other componentes of the culture medium such as amino acids and the products of fermentation have also been implicated in the regulation of CLS. In auxotrophic S. cerevisiae strains CLS is highly affected by the concentration of the auxotrophy-complementing amino acids. Ammonium (NH4 +), a commonly used nitrogen source, is another extrinsic factor affecting CLS regulation in S. cerevisiae. Cells starved for auxotrophic-complementing amino acids and aged in water are particularly sensitive to ammonium-induced cell death and this process is mediated through the regulation of the evolutionary conserved pathways TOR, PKA and SCH9. This effect of ammonium on aging yeast depends on the specific amino acid they are deprived off with starvation for leucine enhancing ammonium-induced CLS shortening (Santos et al., 2013). This work aimed to further elucidate the role of ammonium as a nutrient capable of regulating CLS of S. cerevisiae in culture medium and unveil its interplay with other extrinsic factors, such as pH or glucose, and with the evolutionary conserved pathways. Moreover, the role of glutamine as another rich nitrogen source in aging media was also addressed. The results showed that cells grown with low concentrations of auxotrophy-complementing amino acids and in the presence of ammonium lost viability very fast displaying a very short CLS which was accompanied by an inhibition of a proper cell cycle arrest in G0/G1 phase. Furthermore, the CLS shortening effect induced by amino acid restriction was completely reverted by removing ammonium from the aging medium. It was also observed that buffering media not only to pH 6.0 but also to pH 3.4 largely extended CLS in media with high concentrations of auxotrophycomplementing amino acids (HAA) and with or without NH4 + and in media with low concentrations of auxotrophy-complementing amino acids (LAA) without NH4 +. Buffering LAA media in the presence of NH4 + to either pH 3.4 or pH 6.0 had no measurable effect on CLS. Reducing glucose concentration in media (from 2% to 0.5%) showed that the beneficial effect of calorie restriction (CR) is only observed in LAA medium and in the presence of NH4 +. In fact, the absence of ammonium seems to be so effective in extending CLS that no effect could be observed by imposing CR conditions. In conclusion, this data suggest that ammonium, independently of glucose concentration and pH in the medium during aging is a major responsible for the CLS shortening under amino acid restriction conditions. The deletion of tor1Δ, ras2Δ and sch9Δ showed that Tor1p, Ras2p and Sch9p seem to mediate cell death in LAA media whereas in HAA media Ras2p and Sch9 mediated survival and Tor1p had no effect. Since ammonium-induced cell death is involved in different human disorders that are accompanied by hyperammonemia, these results may also provide new insights into the understanding of the cell molecular bases triggering cell death in such pathologies. Furthermore, the study of the interaction of amino acids and ammonium in the survival of S. cerevisiae offers new approaches for the improvement of wine fermentations.
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem-se destacado como um dos organismo modelo mais importantes para clarificar os factores genéticos e ambientais associados ao envelhecimento. As vias de sinalização de nutrientes envolvidas na regulação da longevidade cronológica são afectadas pela composição do meio de cultura e portanto, a cultura de células em diferentes meios leva a diferenças na longevidade cronológica. Como descrito na literatura, a manipulação dos componentes do meio de cultura pode extender a longevidade cronológica, como acontece com a redução da concentração de glucose. Contudo, também outros componentes do meio de cultura, tal como, os aminoácidos e os produtos da fermentação de leveduras tem sido associados á regulação da longevidade cronológica. Em estirpes auxotróficas de S. cerevisiae a longevidade cronológica é principalmente afetada pela concentração de aminoácidos essenciais (correspondentes ás marcas auxotróficas). O amónio (NH4 +), uma fonte de azoto comum, é outro factor extrínseco que afecta a regulação da longevidade cronológica de S. cerevisiae em meio de cultura. Células cultivadas até á fase estacionária com restrição de aminoácidos essenciais e posteriormente transferidas para água são sensíveis á adição de amónio, ocorrendo um decréscimo significativo na longevidade cronológica. Este processo de morte celular induzida por amónio é mediado pelas vias de regulação TOR, PKA and SCH9 e depende do aminoácido para o qual há restrição, uma vez que se verficou que a diminuição da longevidade é mais acentuada quando há uma restrição especifica de leucina (Santos et al., 2013). O objectivo do presente trabalho consiste no aprofundamento do estudo do papel do amónio como um nutriente capaz de regular a longevidade cronológica de S. cerevisiae em meio de cultura, nomeadamente na elucidação da interação com outros factores extrínsecos como glucose e pH, e com as vias de sinalização. Além disso, foi também abordado o papel da glutamina como outra fonte de nitrogénio capaz de regular a longevidade. Os resultados mostraram que as células cultivadas em meio com restrição de aminoácidos na presença de amónio perdem rapidamente a viabilidade exibindo uma diminuição da longevidade cronológica a qual é acompanhada por uma inibição da entrada na fase G0/G1 do ciclo celular. Mais ainda, o efeito da diminuição da longevidade cronológica induzida pela restrição de aminoácidos pode ser completamente revertido pela remoção do amónio do meio de cultura. Foi também observado que o tamponamento do meio, tanto a pH 3.4 como pH 6.0, estende a longevidade cronológica em meio com alta concentração de aminoácidos com ou sem a adição de amónio e em meio com baixa concentração de aminoácidos sem adição de amónio. Pelo contrário em meio com baixa concentração de aminoácidos na presença de amónio o pH parece não tem qualquer influência na longevidade cronológica. A redução da concentração de glucose no meio de cultura (de 2% para 0.5%) mostrou que o efeito benéfico da restrição calórica só é observado em meio com baixa concentração de aminoácidos e na presença de amónio. De facto, a ausência de amónio parece ser tão eficaz na extensão da longevidade cronológica que nenhum efeito adicional é observado pela imposição das condições de restrição calórica. Em conclusão, estes resultados sugerem que o amónio, independentemente da concentração de glucose e do pH do meio é o principal responsável pela diminuição da longevidade cronológica sob condições de restrição de aminoácidos. A utilização dos mutantes tor1Δ, ras2Δ e sch9Δ mostrou que Tor1p, Ras2p e Sch9p intervêm na morte celular em meio com baixa concentração de aminoácidos enquanto que em meio com alta concentração de aminoácidos Ras2p e Sch9p contribuem para a sobrevivência celular e Tor1p não tem qualquer efeito. Sabendo que a morte celular induzida por amónio está envolvida em patologias humanas que são acompanhadas de hiperamonémia, estes resultados podem fornecer novas pistas para a compreensão desta patologia. Além disso, o estudo da interação de aminoácidos e amónio na sobrevivência de S. cerevisiae oferece novas abordagens que podem ser relevantes para melhorar as fermentações alcoólicas, em particular as vínicas.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado em Genética Molecular
URIhttp://hdl.handle.net/1822/34660
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Dissertações de Mestrado
DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses

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