Functional characterization of ULP2 SUMO proteases in Arabidopsis thaliana

Abstract

In modern times it has become crucial to provide sustenance for a constantly growing world population, and crop improvement is a current major issue, especially considering the added effects of a changing climate and continuous soil impoverishment. In order to address environmental challenges, plants have developed different defense mechanisms, and studying the way that cells respond to these stresses is an increasingly significant area of research. Post-translational modifications (PTM) are major regulators at the molecular level, increasing the complexity of the cellular proteome. One such PTM is the small ubiquitin-related modifier (SUMO), a ubiquitin-like modifier that was recently shown to have prominent roles in plant development and stress responses. The SUMO pathway consists of three enzymatic steps, where SUMO is first maturated by ubiquitin-like proteases (ULPs), and transferred to the target proteins by SUMO activating (E1) and SUMO conjugating (E2) enzymes, with the assistance of SUMO ligases (E3). The process is recycled by ULPs, which promote deconjugation of the peptide from target proteins. The research group has been involved in the novel characterization of ULP2a and ULP2b SUMO pathway components, using the model plant Arabidopsis thaliana. The current work addressed the functional characterization of these proteins using loss-of-function T-DNA insertion mutants. To characterize the involvement of ULP2s in plant abiotic stress responses, the double mutant ulp2a ulp2b was submitted to a number of different abiotic, hormonal and oxidative stresses. ULP2s displayed roles in osmotic stress, as well as in auxin and ethylene responses. An involvement in heat stress responses was also demonstrated. ULP2 mutants were introgressed into the E3 ligase siz1 mutant, showing that SIZ1 was epistatic to ULP2 in the heat stress response, and acted independently of salicylic acid accumulation in siz1. ULP2- GFP fusion proteins were used to localize ULPs to the cell nucleus. In silico analysis was also performed to predict putative ULP2 targets based on homology from known human and yeast targets. Finally, initial studies were carried out to experimentally establish the gene expression pattern of ULP2s using the GUS reporter system.

Nos tempos modernos, tornou-se crucial fornecer o sustento necessário para uma população em constante crescimento, e o melhoramento dos cultivares é um dos principais sectores de preocupação, especialmente considerando os efeitos das alterações climáticas e do contínuo empobrecimento do solo. No sentido de resolver estes desafios ambientais, as plantas desenvolveram diferentes mecanismos defesa, e o estudo da maneira como a célula responde a estes stresses é uma área de investigação de interesse crescente. As modificações pós-traducionais (PTM) são um dos principais mecanismos reguladores a nível molecular, aumentando a complexidade do proteoma celular. Uma destas PTM consiste no pequeno modificador relacionado com a ubiquitina (small ubiquitin-related modifier; SUMO), que se tem demonstrado ter funções importantes no desenvolvimento e na resposta ao stresse em plantas. A via do SUMO consiste em três passos enzimáticos, onde o SUMO é primeiramente maturado pela ação de SUMO proteases (ULPs), e transferido para proteínas alvo pela ação de SUMO ativases (E1) e SUMO conjugases (E2) com a ajuda de SUMO ligases (E3). O ciclo é renovado pelas ULPs, que promovem a desconjugação dos péptidos das proteínas alvo. O grupo de investigação tem estado envolvido na caracterização dos componentes da via do SUMO ULP2a e ULP2b, utilizando como modelo a planta Arabidopsis thaliana. O presente trabalho abordou a caracterização detalhada destas proteínas com a utilização de linhas de inserção de T-DNA. Para caracterizar o envolvimento das ULP2s na reposta a stresses abióticos, o duplo mutante ulp2a ulp2b foi submetido a diferentes stresses abióticos, hormonais e oxidativos. As ULP2s exibiram papéis no stresse osmótico, bem como nas respostas às auxinas e ao etileno. Um envolvimento no stresse pelo calor também foi demonstrado. Os mutantes de ULP2 sofreram introgressão no mutante para a E3 ligase siz1, demonstrando que SIZ1 é epistático para ULP2 na resposta de stresse ao calor, actua de forma independente da acumulação de ácido salicílico em siz1. Fusões ULP2-GFP foram usadas para localizar as ULPs no núcleo da célula. Por sua vez, análises in silico foram efetuadas para prever alvos putativos das ULP2, tendo por base a homologia com alvos de ULP2 em humanos e levedura. Por último, foram iniciados estudos no sentido de estabelecer experimentalmente o padrão de expressão dos genes das ULP2s, utilizando o sistema repórter GUS.