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TitlePhysicochemical characterization of DNA/DODAB:MO Cationic Liposome complexes and study of its potential as nonviral vectors
Author(s)Silva, João Paulo Neves da
Advisor(s)Real Oliveira, M. Elisabete C.D.
Coutinho, Paulo J. G.
Coutinho, O. P.
Issue date12-Dec-2013
Abstract(s)Throughout the last decades, several liposomal formulations have been developed with the goal of condensing, transporting and releasing complementary DNA (cDNA) into cells, thus allowing the treatment of several genetic diseases via DNA replacement therapy. Although this technology has been partially substituted with the more contemporary use of small interference RNA (siRNA) therapy, the intracellular delivery of cDNA still remains the only viable gene therapy approach for stable host genome modification instead of transient transfection. The success of lipofection technique greatly depends on the structural and physicochemical properties of the liposomal carrier and ultimately, on the molecular attributes of the components of the lipid mixture. The empirical testing of diverse families of lipids such as cationic surfactants, pH-sensitive tensioactives or other lipid conjugates has allowed the development of highly efficient nanoparticles that stably condense the genetic material and withstand the harsh destabilizing conditions of the biological environment. However, it is this very same increased carrier stability that is responsible for limiting the gene release from the nucleic acid (NA)/cationic liposome complex (lipoplex) and reducing its final cell transfection efficiency. One recent approach to overcome this problem has come with the inclusion of non-lamellar forming lipids (also called helper lipids) in the liposomal formulation, which potentiate the formation of membrane fusion intermediates that disrupt the lamellar organization of the lipoplexes and favour the release of the genetic content. Molecules such as dioleoylphosphatidyl ethanolamine (DOPE) and cholesterol (Chol) have been employed with success as helper lipids in several liposomal formulations, enhancing the lipofection efficiency through the formation of inverted hexagonal structures (HII). Adopting a similar strategy, the work plan for this thesis was focused on the development of a new nucleic acid (NA)/cationic liposome formulation for gene delivery purposes comprising the synthetic cationic lipid Dioctadecyl Dimethylammonium Bromide (DODAB) and the non-ionic and non-lamellar forming lipid Monooleoyl-rac-glycerol (monoolein, MO). The structural and physicochemical characterization of DODAB:MO liposomes and DNA/DODAB:MO lipoplexes has been done through light scattering, microscopy, spectroscopy (with emphasis in UV/Visible fluorescence emission) and calorimetry techniques. The lipoplex formation process has been studied through the same techniques referred above at varying molar fractions of cationic lipid/DNA and cationic lipid/neutral lipid, while lipoplex destabilization was assessed by incubation of the pre-formed lipoplexes in several physiological simulation environments (salt, serum, temperature, pH, anionic lipids). Finally, the cell transfection efficiency and cytotoxicity profile of these non-viral gene delivery vectors was assessed by β-galactosidase reporter gene expression and Lactate Dehydrogenase (LDH) cell viability assays, respectively, in the 293T human embryonic kidney cell line. The results attained substantiate the high potential for DNA/DODAB:MO lipoplexes to be used as nonviral vectors in gene delivery, and validate the application of MO as helper lipid in cationic liposome formulations, being a viable alternative to classic DOPE and Chol molecules.
Ao longo das últimas décadas, várias formulações lipossomais têm sido desenvolvidas com o intuito de condensar, transportar e libertar DNA complementar (cDNA) em células, permitindo o tratamento de várias doenças genéticas através da terapêutica de substituição de DNA. Embora esta tecnologia tenha sido parcialmente substituída pelo uso mais contemporâneo da terapêutica de RNA de interferência (microRNA), a entrega intracelular de cDNA permanece ainda como a única alternativa viável para a modificação genómica definitiva do hospedeiro em vez da transfeção transiente. O sucesso da técnica de lipofeção depende grandemente das propriedades estruturais e físico-químicas do vetor lipossomal e, em última instância, das propriedades moleculares dos constituintes da formulação lipídica. O teste empírico de diversas famílias de lípidos tais como os surfatantes catiónicos, os tensioativos sensíveis a pH ou outros conjugados lipídicos permitiu o desenvolvimento de nanopartículas altamente eficientes capazes de condensar estavelmente o material genético e suportarem as agressivas condições desestabilizantes do microambiente biológico. Contudo, é esta mesma estabilidade acrescida dos vetores que é responsável por limitar a libertação de genes dos complexos DNA/lipossomas catiónicos (lipoplexos) e reduzir a eficiência final de transfeção celular. Uma abordagem recente para ultrapassar este problema proveio da inclusão de lípidos nãolamelares (também chamados de lípidos adjuvantes) na formulação lipossomal, que potenciam a formação de intermediários membranares fusogénicos que desestabilizam a organização lamelar dos lipoplexos e favorecem a libertação do conteúdo genético. Moléculas tais como dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) e colesterol (Chol) têm sido utilizadas com sucesso como adjuvantes em várias formulações lipossomais, aumentando a eficiência de lipofeção através da formação de estruturas hexagonais invertidas (HII). Adotando uma estratégia similar, o plano de trabalhos para esta tese contemplou o desenvolvimento de uma nova formulação ácido nucleico (NA)/lipossoma catiónico para efeitos de entrega genética, composta pelo lípido catiónico sintético Brometo de Dioctadecil Dimetilamónio (DODAB) e o lípido não-iónico e não-lamelar Monooleína (MO). A caracterização estrutural e físico química dos lipossomas DODAB:MO e lipoplexos DNA/DODAB:MO foi feita através das técnicas de dispersão de luz, microscopia, espetroscopia (com ênfase na emissão de fluorescência UV/Visível) e calorimetria. O processo de formação dos lipoplexos foi estudado através das mesmas técnicas referidas anteriormente em frações variáveis de lipossomas catiónicos/DNA e de lípido catiónico/lípido neutral, enquanto a desestabilização dos lipoplexos foi avaliada pela incubação dos lipoplexos recém-formados em diversos microambientes fisiológicos simulados (sal, soro, temperatura, pH, lípidos aniónicos). Finalmente, a eficiência de transfeção celular e o perfil citotóxico destes vetores genéticos não-virais foi avaliada por ensaios de expressão do gene repórter β-galactosidase e ensaios de viabilidade celular com a enzima Lactato Desidrogenase (LDH), respetivamente, na linha celular 293T derivada de rim embrionário humano. Os resultados obtidos substanciam o elevado potencial dos lipoplexos DNA/DODAB:MO para serem usados como vetores não-virais em entrega genética, e validam a aplicação de MO como lípido adjuvante em formulações de lipossomas catiónicos, apresentando-se como uma alternativa viável às moléculas clássicas DOPE e Chol.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Física)
URIhttp://hdl.handle.net/1822/29565
AccessRestricted access (UMinho)
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
CDF - FAMO - Teses de Doutoramento/PhD Thesis

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